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mTOR信号通路是调控细胞生长与增殖的一个关键通路，该通路整合源于营养分子、能量状态以及生长因子的信号，调控包括蛋白转录、自我吞噬、核糖体的生物功能、代谢和血管新生等许多重要的生命过程。mTOR在多数人恶性肿瘤中高度激活，成为抗肿瘤药物研究和开发新的热点。mTOR变构抑制剂，即雷帕霉素类化合物特异性地抑制mTORCl，其中CCI-779和RAD001已被批准上市用于治疗晚期肾癌。靶向mTOR催化结构域的mTOR激酶抑制剂能够同时抑制mTORC1和mTORC2，在临床前研究显示出比雷帕霉素类似物更强更广泛的抗肿瘤活性，已成为国际上新一类分子靶向抗肿瘤药物研发的热点。 本研究建立了mTOR激酶抑制剂的筛选模型，对新发现的mTOR选择性抑制剂X-387进行了系统的抗肿瘤活性和作用机制研究，并对mTOR激酶抑制剂与Hsp90抑制剂的联合应用进行了初步的探索。 我们采用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达体系表达纯化了mTOR的催化结构域，并建立了基于TR-FRAT(LANCE)检测方法的分子水平激酶抑制剂的筛选模型。通过该模型筛选得到了多个激酶小分子抑制剂。其中吡唑并嘧啶类化合物X-387能够显著抑制mTOR催化结构域的催化活性，IC50为23±6.2nM。X-387对mTOR的抑制活性随反应体系中ATP浓度的上升而下降，表明X-387是可逆的、ATP竞争性抑制剂。X-387不但抑制mTOR激酶区的催化活性还能抑制从细胞中免疫沉淀得到的mTORC1和mTORC2的复合体的激酶活性。在细胞水平上，X-387能剂量依赖性地抑制了三株mTOR信号高度活化的A549、MCF-7和HCT-116细胞内mTORC1和mTORC2介导的信号通路的活性。X-387作用15min内，mTOR的下游信号通路基本被抑制，在X-387作用1h后，撤去化合物更换新鲜培液继续培养，mTOR下游信号通路在15min内能够恢复，表明X-387在细胞水平上对mTORC1和mTORC2的抑制是快速、可逆的。我们发现X-387短期作用不仅能抑制mTORC2底物AKT在Ser473位的磷酸化，还能抑制AKTThr308位的磷酸化。我们通过AKT细胞膜转位实验首次证实这一现象并不是由于X-387抑制PI3K的脱靶效应，而是由于X-387对AKTSer473位的磷酸化水平的抑制限制了AKTThr308位的磷酸化，从而抑制AKT的活性。 通过检测X-387对于本实验室中不同组织来源的多种肿瘤细胞株以及对于NCI60的56株肿瘤细胞株的增殖抑制作用，我们发现mFOR激酶抑制剂对不同组织背景的肿瘤细胞具有广泛的增殖抑制作用。我们进一步在不同基因背景的非小细胞肺癌细胞株中比较了X-387和雷帕霉素的抗肿瘤作用。与雷帕霉素对测试的非小细胞肺癌具有明显细胞选择性相比，X-387具有低选择性高活性的特点。 X-387虽无明显的凋亡诱导作用，但通过抑制mTOR活性，下调多个推进细胞周期演进的蛋白如c-Myc和CyclinD的表达，诱导肿瘤细胞发生G1期阻滞进而抑制肿瘤细胞的增殖。此外，X-387可抑制肿瘤细胞的生长，使肿瘤细胞体积变小。与mTOR在自噬中发挥的重要调控功能一致，X-387对mTOR的抑制导致肿瘤细胞发生自噬。我们首次发现自噬抑制剂3-MA能增强X-387的增殖抑制活性，表明X-387所导致的细胞自噬能部分拮抗X-387的抗肿瘤效应。我们进一步证实了自噬抑制剂3-MA能够使肿瘤细胞对一系列mTOR激酶抑制剂更为敏感。此外，X-387与雷帕霉素相比能够更显著地抑制A549细胞的运动、迁移，这与X-387能抑制细胞内多个运动相关蛋白RhoA、Rac1和Cdc42活性的相关。 在寻求发现新的抑制剂的同时，我们期望能够优化以mTOR为靶点的抗肿瘤治疗策略。我们根据mTOR激酶抑制剂作用特点，即抑制mTORC1可引起上游酪氨酸激酶、PI3K活性的反馈性激活，设计与Hsp90抑制剂联和使用。我们发现Hsp90抑制剂AUY922和mTOR激酶抑制剂AZD8055联合应用对不同基因背景乳腺癌细胞的增殖抑制产生显著的协同效应。我们对产生协同效应的机制进行了初步的探索，发现AUY922可抑制AZD8055引起的PI3K反馈性激活以及AZD8055长时间作用下AKT活性的恢复。 综上所述，我们纯化表达出mTOR催化结构域并建立了以TR-FRAT(LANCE)为检测方法的灵敏高效的筛选体系，并筛选得到多个活性化合物，为发现和研究新型mTOR激酶抑制剂奠定了基础。系统研究了mTOR小分子抑制剂X-387对mTOR激酶的抑制活性和作用模式，并在细胞水平上探索了其抗肿瘤作用特点和机制，揭示了该类化合物具有抑制肿瘤细胞增殖和运动的活性。该研究不仅为发现具有抗肿瘤活性更好的mTOR激酶抑制剂提供了先导化合物，而且阐释了mTOR激酶抑制剂X-387下调Akt苏氨酸308位的磷酸化以及抑制细胞运动机理，丰富了mTOR信号通路的内涵。我们发现自噬抑制剂能够增强mTOR激酶抑制剂的抗肿瘤活性，还发现Hsp90抑制剂AUY922通过抑制mTOR激酶抑制剂AZD8055所产生的负反馈和AKT活性的恢复，从而产生协同抑制肿瘤细胞增殖的作用，为药物联合应用，提高以mTOR为靶点的抗肿瘤疗效提供了理论依据。