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多叶重楼Parispolyphylla是重要的药用植物,为著名中成药“云南白药”的主要原料。由于长期以来的过度采集,其野生居群规模迅速缩小,遗传多样性逐渐下降。本研究从形态和分子水平,分析其遗传多样性和遗传结构,并对其种子繁殖进行了初步研究;同时,基于ITS序列分析,运用分子系统学的方法对重楼属系统发育关系进行探讨。
1重楼属植物是多年生草本植物。其生活史有以下特征:营养生长期(出苗展叶展花)→授粉期(花粉囊开放至干枯)→果熟期(花粉干枯至果实开裂)→衰老期(花枯叶枯茎枯倒苗),其中在植株个体发育的过程中,果熟期占一半时间。从滇南和滇东南引种来的重楼,地上部分(茎、叶及其果实)生活的时间一般较长。重楼植物的繁殖方式为有性繁殖和营养繁殖,有性繁殖为虫媒授粉,但能发育成熟的果实较少。引种居群往往需要人工授粉。重楼属植物的种子较大,种子可能通过重力或动物传播,在适宜的自然条件下能自然萌发。营养繁殖以根茎繁殖方式进行切段繁殖。
2对多叶重楼及其近缘种的27个表性形状调查分析发现:在同一物种内,营养器官性状变异程度比生殖器官大;同一性状在不同变种和种间变异幅度较大。说明生境对重楼属植物表型有较大饰变作用。
利用光学显微镜对多叶重楼及其近缘种的叶表皮进行观察发现,表皮细胞形状、垂周壁式样、气孔类型及形状都属于比较恒定的性状,而气孔分布特征、气孔指数、气孔大小在不同种、变种间表现出较稳定的差异。
3通过研究温度、赤霉素和MS培养基对滇重楼P.polyphyllavar.yunnanensis和南重楼P.vietnamensis种子萌发的影响,发现温度处理有利于种子萌发,可以大大缩短出苗时间,滇重楼萌发的最适温度是18~22℃,南重楼萌发的最适温度是22~25℃,而赤霉素对种子萌发无明显促进作用,MS培养基则有抑制作用。
4采用DALP(Directamplificationoflengthpolymorphism)分子标记技术,对多叶重楼Parispolyphylla三个变种:滇重楼P.polyphyllavar.yunnanensis、七叶一枝花P.polyphyllavar.chinensis、长药隔重楼P.polyphyllavar.pseudothibetic共7个居群进行DNA片段多态性检测,并与1个凌云重楼P.cronquistii居群,1个南重楼P.vietnamensis居群和1个毛重楼P.mairei居群进行比较。筛选出5个引物组合,扩增共产生183条DNA片段,其中180条谱带具有遗传多态性,约占98.36%,平均每组引物扩增所得多态条带为36。多叶重楼其物种水平的多态位点百分比(PPB)为93.99%,Shannon指数为0.3935,遗传分化系数(Gst)为0.4504。多叶重楼其变种水平表现为,滇重楼PPB为79.23%,Shannon指数I为0.3311,Gst为0.3667;七叶一枝花PPB为59.56%,Shannon指数I为0.2667,Gst为0.3419;长药隔重楼居群PPB为46.45%,Shannon指数I为0.2069。凌云重楼居群PPB为44.26%,Shannon指数I为0.2132。毛重楼居群PPB为48.09%,Shannon指数I为0.2483。南重楼居群PPB为33.88%,Shannon指数I为0.1683。聚类分析显示滇重楼、七叶一枝花和长药隔重楼聚为一类,并与毛重楼有较近的亲缘关系,而与南重楼和凌云重楼遗传距离较远。
5运用PCR直接测序法,对重楼属Paris6个种,3个变种,1个杂交种的nrDNA的ITS区(包括ITS-1、5.8SrDNA和ITS-2)进行序列测定。重楼属植物的ITS序列总长度为630-639bp,ITS1长度为241-247bp,ITS2长度为234-238bp。变异多发生在ITS1和ITS2区,变异位点为45个,其中信息位点为36个,占ITS序列总长的5.68%。采用MEGA2.0软件进行系统发育分析表明:支持将重楼植物重新划分为独立的3个属。但由于信息位点数较低,对属内组间的关系还不明确,研究重楼属系统发育关系还需要新的数据。
调查发现,造成重楼属植物濒危的主要原因是,过渡采集、生境破坏及生境片断化、有性生殖效率不高、种子转化成幼苗的转化率低、生长缓慢、无性繁殖对居群繁殖的贡献率极其有限等。由于多叶重楼种内分化剧烈,考虑到迁地保护难以确保各变种或居群的遗传多样性,必须考虑原位保护的措施和办法。最重要的是,针对重楼属的濒危状况,制药企业必须实施GAP种植,并以种子实生苗繁育为主,才是解决重楼药用植物原料紧缺和保护资源的根本办法。