研究背景肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)占85%左右。NSCLC综合治疗策略包括手术、化疗、放疗和分子靶向治疗。然而，由于肿瘤的异质性和多药耐药，近年来NSCLC患者总的获益空间并未得到显著提升，临床治疗遭遇瓶颈。因此，有必要对NSCLC的生物学行为进行深入研究。前期大量研究证实，NSCLC的发生发展与多基因转录及转录后的异常调控有关。RNA结合蛋白(RNA-binding proteins, RBPs)是近年来新发现的具有多种生物学作用的一系列分子家族的总称，参与真核生物基因表达的调控作用，尤其是转录后调控机制。高度保守的胚胎致死异常视觉(embryonic lethal abnormal vision, ELAV)家族的RNA结合蛋白HuR(human antigen R)及锌指蛋白tristetraprolin(TTP)是两种常见的RNA结合蛋白。既往研究及发现，HuR与TTP可以作用于靶mRNA的3’末端未翻译区(3’untanslated region,3’UTR)的富含腺嘌呤和尿嘧啶的序列(AU-rich elements,AREs)，影响肿瘤相关分子的表达，进而参与恶性肿瘤的形成和转移过程。我们以前在NSCLC、乳腺癌、食管癌中，对HuR参与的肿瘤转移、耐药等进行了系列研究，但在NSCLC中多种RBPs间的相互作用并未见报道。近年来微小RNA(microRNA, miRNA)的功能成为大量研究关注的重点。miRNA作为一段高度保守的核酸序列，也是调控真核基因表达的分子，特别是在恶性肿瘤的进程中miRNA参与了细胞增殖、凋亡、转移等过程，其机制是在转录后水平调控基因的表达。我们前期研究发现，在NSCLC中miR-133b的表达明显缺失或下调，可能影响了NSCLC患者预后。由于RBPs和miRNA作用的区域均是3’UTR，其机制均涉及转录后调控，这两种分子可能共同控制了某些关键分子的表达，或存在互调控机制，影响肿瘤的发生发展。目的本课题将以NSCLC为研究对象，分析RNA结合蛋白HuR、TTP与miR-133b在NSCLC中的表达和预后作用，为进一步探讨RBPs和miRNA分子间的相互作用提供基础，也可为NSCLC治疗提供新的靶点。方法1.收集2010.01-2013.08济南军区总医院的非小细胞肺癌石蜡标本110例，石蜡非肿瘤肺组织标本80例，新鲜冰冻肺癌标本及癌旁组织标本各33例。110例石蜡标本中包含了29例同时具有新鲜冰冻组织标本患者的标本。2.采用免疫组织化学方法检测110例非小细胞肺癌及癌旁组织中HuR及TTP的表达水平。3.采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测所有标本中miR-133b的表达情况。4.通过门诊或电话进行随访，截止日期到2014年3月。随访内容包括治疗效果、复发时间、复发后治疗方式及生存时间等多项指标。5.采用SPSS13.0统计软件进行分析。实验数据以均数±标准差表示，两组均数之间的比较用student’s t检验，非参数统计采用秩和检验(Wilcoxon signed-rank test)，独立样本间比较采用两个独立样本检验(Mann-Whitney U test)。计数资料采用χ2检验。生存分析采用Kaplan-Meier曲线法、Log rank检验和Cox回归模型进行分析。以P <0.05表示有统计学意义。结果1.HuR在非小细胞肺癌细胞胞浆的阳性表达高于癌旁组织免疫组化结果显示，非小细胞肺癌组织中胞浆HuR的阳性表达率为61.82%(68/110)，胞核HuR阳性表达率为100%(110/110)；癌旁组织中胞浆HuR的阳性表达率为3.64%(4/110)，胞核HuR阳性表达率为98.18%(108/110)。非小细胞肺癌胞浆HuR的表达与癌旁组织相比具有较明显的差异(P <0.0001)，而胞核的表达差异无明显统计学意义(P <0.498)。统计学分析显示，胞浆HuR的表达与多种临床病理特征均不相关。2.TTP在非小细胞肺癌细胞胞浆的阳性表达低于癌旁组织免疫组化结果显示，非小细胞肺癌组织胞浆TTP的阳性表达率为35.45%(39/110)，胞核TTP阳性表达率为35.45%(39/110)；癌旁组织中胞浆TTP的阳性表达率为49.09%(54/110)，胞核TTP阳性表达率为29.09%(32/110)。非小细胞肺癌胞浆TTP(P=0.028)的表达与癌旁组织相比具有统计学差异，而非胞核(P=0.336)。非小细胞肺癌胞浆TTP的表达与pTNM分期密切相关(P=0.017)，与其他临床病理特征(性别、年龄、肿瘤大小、病理类型、分化程度、淋巴结转移、远处转移及肿瘤浸润深度)不相关。3．miR-133b在新鲜冰冻非小细胞肺癌组织的表达低于新鲜癌旁组织，且与分期相关33例新鲜非小细胞肺癌组织2-△CT：0.0155±0.06616；新鲜癌旁组织：2-△CT：0.0397±0.13634，Wilcoxon秩和检验进行比较(P=0.033)，新鲜肺癌组织miR-133b的表达低于新鲜癌旁组织。新鲜冰冻肺癌组织中miR-133b的表达是新鲜癌旁组织的0.168倍，远低于癌旁组织。以非小细胞肺癌组织中miR-133的相对表达量0.168为标准，33例标本中共有16例miR-133b低表达，17例高表达。结合临床病理特征进行Fisher精确χ2检验，33例新鲜非小细胞肺癌组织miR-133b的表达只与pTNM分期相关(P=0.032)，与性别、年龄、肿瘤大小、病理类型、分化程度、有无淋巴结转移及远处转移无关。4．miR-133b在石蜡非小细胞肺癌组织的表达低于石蜡非肿瘤肺组织，且与肿瘤大小及分期相关扩充纳入研究病例数量，继续采用RT-PCR方法测定对110例非小细胞肺癌石蜡标本及80例非肿瘤肺组织标本。非小细胞肺癌石蜡标本2-△CT:0.0041±0.0184，非肿瘤肺组织石蜡标本2-△CT：0.0100±0.0266。两个独立样本检验Mann-Whitney U检验(P<0.0001)，提示差异具有统计学意义。石蜡非小细胞肺癌组织中miR-133b的表达是石蜡非肿瘤肺组织的0.127倍，远低于石蜡非肿瘤肺组织。因此，可以认为在非小细胞肺癌中miR-133b的表达明显降低。以非小细胞肺癌中miR-133b的相对表达量0.127为标准，110例患者中共有56例miR-133b低表达，54例miR-133b高表达。结合临床病理特征进行χ2检验，110例石蜡肺癌组织miR-133b的表达与肿瘤大小(P=0.015)及pTNM分期(P=0.032)相关，与性别、年龄、病理类型、分化程度、浸润深度、有无淋巴结转移及远处转移无关。5．miR-133b在新鲜冰冻非小细胞肺癌组织与石蜡肺癌组织中表达检测无明显差异对29例同时收集到新鲜组织及石蜡组织的非小细胞肺癌组织标本中miR-133b的表达程度进行对照，研究新鲜组织和石蜡组织中提取miRNA的异同。29例新鲜肺癌组织2-△CT：0.0160±0.07041；石蜡肺癌组织：2-△CT：0.0103±0.03385，Wilcoxon秩和检验P=0.443，因此认为新鲜肺癌组织和相同来源的石蜡肺癌组织的表达的差异无统计学意义，即两种组织处理方法对miR-133b的表达的差异无明显影响。6.胞浆HuR阳性表达、胞浆TTP阴性表达与miR-133b低表达三者具有相关性胞浆HuR阳性表达与胞浆TTP阴性表达呈正相关(P=0.035)，与miR-133b低表达呈正相关(P=0.034)；胞浆TTP阴性表达与miR-133b低表达呈正相关(P <0.0001)。7.非小细胞肺癌中，胞浆HuR阳性表达、胞浆TTP阴性表达和miR-133b低表达影响预后在110例标本中，miR-133b表达与降低的DFS(Log Rank P=0.025)、OS(Log RankP=0.048)显著相关。虽然胞浆HuR表达(DFS；Log Rank P=0.712；OS Log Rank P=0.220)及胞浆TTP表达(DFS；Log Rank P=0.060；OS Log Rank P=0.094)对生存无影响，但有显著性差异的趋势。结论1.非小细胞肺癌中两种RNA结合蛋白HuR和TTP的胞浆表达呈负相关。2.无论是新鲜冰冻非小细胞肺癌组织和癌旁组织对照还是石蜡非小细胞肺癌组织较石蜡非肿瘤肺组织，miR-133b的表达均明显降低。石蜡组织作为一种标本来源进行miR-133b的实验研究。3.在非小细胞肺癌中，miR-133b的低表达、胞浆HuR阳性表达及胞浆TTP阴性表达三者之间具有一定相关性，且影响NSCLC患者的生存。将来的研究应该集中在体外分析这三种分子间的相互作用。开展大样本的前瞻性或回顾性的研究进一步分析HuR、TTP及miR-133b对NSCLC的预后影响也势在必行。