【摘 要】
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产甘油假丝酵母（Candida glycerinogenes）是从自然界筛选到的甘油产量最高的工业化生产菌株,其生长速度快、耐高渗透压、可浓醪发酵、糖代谢迅速,尤其是渗透压调控代谢的特性具有在发酵工业广泛应用的潜力,但尚无较好适用于该酵母的分子改造体系,故创建适用于该工业酵母的整合表达体系十分必要。本论文旨在试探创建一种以渗透控制表达强度的C.glycerinogenes的整合表达体系,同时,考察
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产甘油假丝酵母（Candida glycerinogenes）是从自然界筛选到的甘油产量最高的工业化生产菌株,其生长速度快、耐高渗透压、可浓醪发酵、糖代谢迅速,尤其是渗透压调控代谢的特性具有在发酵工业广泛应用的潜力,但尚无较好适用于该酵母的分子改造体系,故创建适用于该工业酵母的整合表达体系十分必要。本论文旨在试探创建一种以渗透控制表达强度的C.glycerinogenes的整合表达体系,同时,考察该体系的渗透压调控表达特性,并以该体系为基础,在C.glycerinogenes木糖代谢途径分子改造中应用。主要结果如下:（1）为获得重组整合表达体系受渗透压调控启动子,通过克隆了C.glycerinogenes的胞浆NAD+-3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因（CgGAP）,寻找并获得了其上游调控启动子P CgGAP。对该基因转录水平的分析确认C.glycerinogenes的CgGAP基因受渗透压调控,这与酿酒酵母完全不同;基因分析发现,CgGAP启动子序列中含6个渗透压胁迫顺式调控元件（STRE）;以荧光蛋白基因gfp为报道基因进一步验证:CgGAP启动子是一种可以受渗透压调控并调节外源基因表达强度的新型启动子;（2）重组整合表达体系选用C.glycerinogenes 5.8S rRNA为同源重组整合位点,通过已报道相关信息的对比分析,利用反向克隆技术获得了C.glycerinogenes的5.8S r RNA序列,并依据该序列构建适用于C.glycerinogenes的重组整合表达载体pURGAP、pURGPD,通过研究还发现:重组整合表达载体以5.8S r RNA序列为整合位点可显著提高转化效率,并明显增强外源蛋白表达强度,是C.glycerinogenes一个优良的同源重组整合位点;（3）由于C.glycerinogenes细胞壁较为刚性,转化效率很低。为提高基因转化效率,优化了C.glycerinogenes原生质体的制备和再生条件:以对数生长中期的菌体,OD600约为1.2-1.6,0.6-0.7 mol?L-1 KCl作为渗透压稳定剂（pH 6.5）,破壁酶浓度20 mg?mL-1,酶解温度30°C,摇床转速100 r?min-1,酶解反应时间2 h,可获得较高原生质体制备率;再生培养基中添加1 mol?L-1山梨醇时,原生质体再生率可达到15%。以PEG/Li+介导转化原生质体转化C.glycerinogenes,转化效率提高了1.4倍;（4）利用绿色荧光蛋白GFP的表达强度研究该同源重组整合表达体系受渗透压调控的表达效果并实现基因表达强度可调控,对不同酵母来源GAP启动子在C.glycerinogenes中受渗透压调控水平考察发现,不同渗透压调节剂对重组整合表达载体的渗透调控强度存在明显差异,其中,NaCl对重组整合表达载体的渗透调节性能最强,绿色荧光蛋白的平均荧光强度比对照提高了12倍,说明:所构建的重组整合表达体系对外源基因进行表达,不仅可利用渗透压强度调控,还可通过不同渗透压诱导剂（碳源葡萄糖、NaCl等盐类及甘油等有机物）进行表达控制,与广泛使用的单一化学诱导剂表达系统相比,多种诱导剂渗透压调控重组整合载体的表达为实际应用提供了方便;（5）为进一步验证重组整合表达体系在工业菌株C.glycerinogenes中的应用,在C.glycerinogenes中引入五碳糖-木糖代谢途径,并利用木糖生产木糖醇及甘油。利用重组整合表达载体受渗透压调控表达的特性,以葡萄糖及NaCl作为渗透压调节剂,以木糖及葡萄糖共底物发酵时,甘油产量最高可达62 g?L-1,比野生C.glycerinogenes提高了103.2%;木糖醇产量最高可达66.1 g?L-1左右,比野生C.glycerinogenes提高了62.3%;20-30 g?L-1甘油作为共底物,木糖醇的转化率最高可达80%,说明该分子操作体系成功提高了工业酵母利用五碳糖-木糖的能力,为C.glycerolgenesis分子改造提供成功的案例。
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