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腹泻性贝类毒素(diarrhetic shellfish poisoning,DSP)是由某些甲藻产生,经贝类摄食聚集于体内后,通过食物链传递到高等生物而造成危害的毒素。DSP毒素包含okadaic acid(OA)、dinophysistoxins(DTXs)及其衍生物,以及pectenotoxins(PTXs)。鳍藻(Dinophysis spp.)是腹泻性贝类毒素的产毒藻之一,是世界广布种,几乎遍布整个沿海国家,包括英国、克罗地亚、挪威、智利、巴西、罗马尼亚、瑞典,加拿大、美国、中国、日本以及大西洋等热带、亚热带海域。虽然鳍藻在世界分布广泛,但是北美洲关于DSP毒素中毒事件的报道却非常少,特别是发生在美国东海岸的DSP有害藻华事件与欧洲、南美洲以及亚洲海域的DSP事件形成鲜明对比,因此,了解影响鳍藻中DSP毒素积累的因素是什么?与鳍藻本身的产毒能力是否有关?不同海域,同种鳍藻的产毒能力是否相同?如果鳍藻具有的不同的产毒能力,是否与当地海域的生长环境有关,是否与营养物质的来源有关,是否是各种因素共同作用的结果?为解决这些问题,本论文在成功建立鳍藻培养体系的基础上,对影响鳍藻生长和产毒的环境、营养和基因调控等方面因素进行研究。
首先,本研究成功建立了来自美洲不同海域的鳍藻培养体系,并对其形态分类学、分子分类学和毒理特征差异进行分析,结果表明,来自北美洲东海岸Woods Hole, Marthas Vineyard和Bay of Fundy的三株鳍藻DAEP01、DAMV01和DABOF01在形态、分子以及毒理特征上相似,被鉴定为渐尖鳍藻Dinophysisacuminata,而另外两株来自北美洲南部墨西哥海域和南美洲智利海域的藻株DAPA01和DARE01与其它三株形态、分子以及毒理特征鉴定上有明显差异,因此将这两株鳍藻归属为渐尖鳍藻复合种Dinophysis acuminata complex。
其次,本文对不同海域鳍藻生长的株系、环境和食物影响因素进行研究,结果表明,在相同的生长和培养条件下,被鉴定为渐尖鳍藻D. acuminata的两株北美洲东海岸鳍藻,DAEP01和DAMV01有相似的生长率和最大生物量,而另外一株被鉴定为渐尖鳍藻复合种D. acuminata complex,来自北美洲南部墨西哥海域的藻株DAPA01生长率和最大生物量比上述两株鳍藻明显偏低。对影响鳍藻生长的环境因素研究表明,温度越高(4~10℃),鳍藻生长率越高。但是在相对较高的两个温度下(6和10℃),鳍藻的生长率无明显差异,这种变化很可能是由于高温下(10℃),食物红色中缢虫的质量和数量明显下降导致。此外,光照对鳍藻生长有明显的影响,在黑暗条件下,鳍藻不能生长,但光照范围为65~300μmolphotonsm-2s-1时,鳍藻生长没有显著变化,表明影响鳍藻生长的光照限在0~65μmol photonsm-2s-1之间。环境中营养元素含量(N:P比例范围为7~81)以及食物质量(食物体内氮磷含量不同)对北美洲渐尖鳍藻DAMV01的生长也没有显著影响。综合上述结论,渐尖鳍藻是光合混养生物,其生长同时需要光照和食物两个生长因素,但是食物质量(非食物数量)对鳍藻的生长和生物量没有影响,此外,渐尖鳍藻也不能吸收溶解态氮和磷等营养元素。
再次,本论文采用高效液相色谱-串联质谱(LC/MS-MS)的方法对鳍藻的腹泻性贝类毒素产生量进行了检测,首先对北美洲渐尖鳍藻DAEP01的产毒能力进行了肯定,确定其产毒成分包括OA,DTX1,PTX2,和okadaic acid diol ester(OA-D8)。随后,本论文对鳍藻产毒的生长周期、环境和株系差异进行研究,结果表明,在整个北美洲渐尖鳍藻DAEP01生长过程中,OA,DTX1,OA-D8和PTX2毒素都可以在藻细胞中检测出来,且生长周期对鳍藻产毒有较大的影响。所有毒素含量在细胞生长的对数生长期较低,在平台生长中期明显升高,而OA-D8和DTX1在平台生长末期浓度变化趋势不明显,OA和PTX2浓度则出现显著降低。尽管DSP的最高毒素含量出现在细胞的平台生长中期,但最高毒素产生率却发生在细胞的对数生长期,这与对数生长期较低且恒定的细胞毒素含量形成对比,表明此时细胞生长与产毒相平衡,细胞的生长率与产毒率呈1:1的正相关关系。而到了平台期,由于藻细胞停止分裂,导致DSP毒素在细胞内的积累,而浓度达到最高。光照对该株鳍藻的产毒影响明显,在黑暗条件下,该株鳍藻的产毒量最低,但在光照强度为65~300μmol photonsm-2s-1时,光照对其产毒影响不明显。温度(4~6℃)对其产毒量和产毒率也没有明显影响。
生长周期对北美洲渐尖鳍藻DAMV01的产毒影响与DAEP01相类似,在整个鳍藻DAMV01的生长过程中,OA,DTX1和PTX2都被定量检测出来,且所有毒素在对数生长期较低,但在平台生长期积累较高。除细胞毒素含量被检测外,溶解态毒素也在鳍藻DAMV01中得到确认,且在平台生长末期,溶解态毒素含量最高。总毒素含量(细胞内+细胞外)在平台生长期有持续增加的趋势。高浓度的游离毒素对于鱼卵和摄食活动将产生影响。
此外,本论文还对来自不同海域的鳍藻产毒组分进行分析,在培养条件完全一致的情况下,北美洲三株渐尖鳍藻DAEP01,DAMV01和DABOF01的产毒特征基本相似,主要包括OA、DTX1和PTX2,而渐尖鳍藻复合种,采自墨西哥湾的藻株DAPA01仅产生OA毒素,采自智利的藻株DARE01仅产生PTX2。定量分析结果表明,三株产毒组分相同的渐尖鳍藻DAEP01、DAMV01和DAPA01具有相似的产生OA族毒素(OA+DTXs)的能力,其总OA族毒素(OA+DTX1,细胞内+细胞外)含量相似,但渐尖鳍藻复合种DAPA01细胞内OA毒素含量最高,其次为DAEP01,而DAMV01产OA毒素能力最弱;PTX2在DAEP01和DAMV01中的含量无显著差异。这些数据表明,虽然三株鳍藻产生DSP毒素含量类似,但是来自Gulf of Mexico的渐尖鳍藻复合种DAPA01具有明显较高的OA含量,而OA毒素是所有DSP毒素组分中毒力最强的毒素,因此该海域的鳍藻在贝类体内的累积以及对人身健康的风险要明显高于DAEP01和DAMV01。
本研究不但可以对鳍藻有害藻华的发生、发展以及消亡过程深入了解,而且通过研究DSP毒素在有害藻华的不同发展时期的产生及积累机制,建立鳍藻有害藻华的预警模型,也为有害藻华发生期,贝类养殖区的开放及关闭,提供理论依据,减少DSP毒素对人类的危害。