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白腐菌具有三种重要的木质素降解酶:锰过氧化物酶(Manganese Peroxidase/MnP)、漆酶(Laccase)和木质素过氧化物酶(Lignin Peroxidase/LiP)。因此,白腐菌对木质素具有很强的降解能力。其中MnP是木质素起始降解的关键酶之一,MnP是真菌分泌的一种糖基化含铁血红素的胞外过氧化物酶,分子量在38～62.5 kDa之间,广泛存在于白腐菌中。在Mn2+和H2O2存在时,MnP能氧化分解芳香环多聚体。目前国内对白腐菌MnP的研究多集中在酶学的基础上,染料的脱色、纸浆的生物漂白、有机污染物的降解等。对于白腐菌MnP的分子生物学研究还相对较少。猴头菇Hericium erinaceus是家喻户晓的药食两用的真菌,国内外对其营养功效、抗病机理及栽培特性已有具体研究,而猴头菇又是我国东北林区的一种木材白腐菌,其木质素降解酶系统及其基因的研究还尚属空白。研究猴头菇分解木质素的酶系统及其基因结构和表达,可为深入研究猴头菇分解木质素酶系统的作用机理以及酶基因的表达调控等分子生物学机制提供基础研究,对进一步构建优良工程菌株具有重要意义和理论价值。
本文对猴头菇菌株CB1和灰树花菌株迁西二号进行了系统发育分析和主要木质素降解酶系统的检测;并对猴头菇菌株CB1 MnP的cDNA基因进行了克隆和序列分析,主要研究结果如下:
1.对白腐菌猴头菇菌株CB1(H.erinaceus CB1)和灰树花菌株迁西二号(Grifolafrondosa qx2)进行了ITS序列扩增与测序(GenBank登录号分别为GU584100和GU584099),并对猴头菇和灰树花及相关白腐菌进行了基于ITS序列的系统发育分析。结果表明H.erinaceus CB1和G.frondosa qx2与属下种间及其它相关的白腐真菌聚类成群。这些聚类成群的白腐菌之间遗传距离较近,亲缘与系统发育关系较密切。
2.采用LNAS培养基在4种不同的培养液中对白腐菌猴头菇菌株CB1(H.Erinaceus CB1)和灰树花菌株迁西二号(G.frondosa qx2)的木质素降解酶系统进行了锰过氧化物酶、漆酶和木质素过氧化物酶活性检测。结果表明,猴头菇和灰树花可同时产生MnP和Laccase。但都不产生LiP,两种酶的活性变化是有规律的。在含有Mn2+及添加了酶作用底物木屑和2,6-DMP的培养液中可同时检测到MnP和Laccase的活性变化;在不含Mn2+的培养液中这两种白腐菌均未检测到MnP的活性变化,但可检测到Laccase的活性变化;猴头菇在含Mn2+但未添加底物的培养液MnP最大酶活仅为3.23U·L-1,Laccase最大酶活仅为2.41 U·L-1;灰树花MnP最大酶活仅为2.82 U·L-1,Laccase最大酶活仅为4.49 U·L-1。证明了Mn2+是猴头菇和灰树花产生MnP的必要因子,而Laccase的产生则不受该条件的制约。在含Mn2+的LNAS培养基中加入木屑为底物条件下,猴头菇MnP最大酶活为45.56U·L-1,Laccase最大酶活为61.85U·L-1;灰树花MnP最大酶活为8.06U·L-1,Laccase最大酶活仅为9.85U·L-1,表明不同白腐菌之间酶的活性差异很大。在培养液内添加酶作用的底物木屑和2,6-DMP后,可以轻微地提高MnP和Laccase的分泌量,表明底物对于白腐菌的木质素降解酶系统可产生诱导作用。
3.采用简并PCR、RT-PCR、RACE等方法扩增出猴头菇成熟菌丝中MnP的cDNA全长基因,命名为He-MnP(GenBank登录号为HM116841)。该基因含有1068 bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),起始密码子ATG,终止密码子TAA,编码355aa,5非翻译区(5UTR)有23个核苷酸,3非翻译区(3UTR)有130个核苷酸。根据He-MnP的cDNA基因,分别在起始密码子ATG和终止密码子TAA附近碱基设计上下游引物,以猴头菇基因组DNA为模板,扩增得到1535bp MnP全基因序列,经过NCBI对比两条基因的全长序列He-MnP共有8条内含子。并根据He-MnP的cDNA全长序列采用网络工具及分析软件推测了该基因的氨基酸及蛋白的生物学特性。