H9亚型禽流感病毒（AIV）近年在我国部分地区广泛流行，给养禽业造成了严重的经济损失。油乳剂全病毒灭活苗虽对该亚型禽流感的控制发挥了重要作用，但由于其存在干扰免疫监测及成本较高等缺点，使用受到了限制。为了研制新型禽流感疫苗以克服上述缺点，我们对H9亚型AIV中国分离株的血凝素（HA）基因和鸡Ⅱ型干扰素基因（IFN-Ⅱ）进行了克隆、测序和分析，构建了表达HA基因及共表达HA基因和鸡IFN-Ⅱ基因的两种重组鸡痘病毒（rFPV-HA、rFPV-HA-IFN-Ⅱ），并测定了它们的免疫效力。1 H9亚型AIV中国分离株HA基因cDNA的克隆及序列初步分析 以酚-SDS法提取H9N2亚型AIV中国分离株A/Chicken/China/F/1998（简称F株）的基因组RNA，以此为模板，采用cDNA合成法及反转录聚合酶链式反应（RT-PCR），扩增到长度分别为1.1Kb和0.8Kb的两段HA基因片段。测序结果表明，这两个片段覆盖了HA基因的完整阅读框架，且在它们的重叠区有单一的PstⅠ酶切位点。利用这一酶切位点，将这两个片段连接成插入在质粒pUC18的HindⅢ和SalⅠ位点之间的全长HA基因，得重组质粒pUCHA。测定pUCHA位于HindⅢ和SalⅠ位点之间外源片段的核苷酸序列。 本研究获得的HA基因片段共有1708个核苷酸，包含了HA完整的阅读区的1680个核苷酸，推测其编码560个氨基酸，其中前18个氨基酸为信号肽序列，其余542个氨基酸组成的前体蛋白在第320位氨基酸处被切割为HA1和HA2多肽。F株HA裂解位点的氨基酸序列为RSSR↓GLF，不含连续的碱性氨基酸，具有低致病性AIV HA裂解位点的特征。F株与H9亚型AIV原型毒株A/Turkey/Wisconsin/1/66（H9N2）的HA基因的同源性较低，氨基酸和核苷酸的同源性分别为84.1％和82.9％。n 扬州大学博士学位论文 以 HAI CDNA的 55－1004 n酸为基元，建立 1992－1999年间 HgNZ亚型 AIV中国及绷边国家和地区分离株的遗传发生树。结果表明，近年来在这一地区流行的HgNZ亚型AJV招可敞为三憎系，同一谱系内，毒株间HA艄酸的同源性在95％以上。F株与髓地区的部分俯株及94年北京分离株的亲龈系较近，形成谱系卜 香港地区的另一些分离株和巴基斯坦分离株形成谱系2，它们与某些南美分离株的亲缘关系很近；与谱系1的亲缘关系也较近，它们之间HA核昔酸的同源性在 gi％R右；韩国分离株形成的谱系 3，该谱系与谱系 1、二的亲缘关系很远，它们之间HA核昔酸的同源性只有83％左右。2 表达HA辜因的直组鸡痘病霉的构巨 以 Hnd皿及 Sal消化PUCHA，得到 1．7Kb的 HA基因片段，将n向插人FPV插入载体 11 75的 Hnd Ill和 Sal位点之间，使之处于痘苗病商启动子 P7．5的下游，得到转移删 11 75HA。按常规的B眠脓染方法将其转染至已感染 FPV中国疫酣282E4（Wt郴）的鸡胚成纤测胞（CEF），通过筛选蓝色的病毒腑获得并纯化重组鸡痘病毒uV－HA。以PCR ＄＄1；ill实，dq，v－HA基因组中插有HA基因：以间接兔疫荧光肌实，fPV－HA感染的C扭釉了HA。3 表达鸡IFN－H羹因的匣组鸡痘病羹的钩 来达产物的生物活性 根据已发表的鸡 WN0基因序列，设计一对5！物，以 RTPCR方法从经 Con A刺激的鸡脾脏细胞中扩增出全长的鸡IFN二基因的cDNA序列。将扩增的基因片段定向插人质粒 AF09的 Sal和 Hnd IH位点之间，使其位于痘苗病毒早晚期启动子PEI的下游。 根据启动子 P肌的序列设计上游引物，鸡 IFNl基因的 cDNA 3 M列设计．下游5！物，以PCR法扩增包含痘苗病毒早晚期启动子PM在内的鸡IFN刁的基因片段。经一系列步骤，将扩增片段定向插人 FPV JWA载体 11 75中，得到转移载体1175IFN，用以转染已感染tFPV的CEF，并按上述重组病毒的构建和纯化方法，获得插谰 rw－n基因的靴重赈毒 ev－r：w－11。在 rrnv－lrx－11中，rw－11基因处于PDe的转录调控下。 以细胞病鲫制W侧－IFNI感染的CEF越了具有抗水泡性口炎病毒（VSV）活性的鸡IFN刁。fPV－mI（M．O．H．m）感染CEF 72小时后，培养上清中 IFN刁的表达量为 1280 U／ITl。动物硼表明，接种 rFPV－IFN刁 天或14天后，其表达的 IFNJ可显著减轻载体鸡痘病毒对 1日龄 SPF tills｛＄重增长的 程坚：表达和共表达Hg亚型肖流感病毒HA基因和鸡！FN坝基因的重组鸡痘病毒 ＊ 抑制作用。 4A表达HA墓因和鸡HN－11基因的直组鸡扈清羹的构建 经一系列步骤，将IFN－11的基因及其上游的启动子PM插人含全长HAcDNA 的质粒pUCm中，得重组质粒PHAIFN。在PHAJFN中，HA基因和IFN刁基因 的3’糊邻。将串联在一起的HA基因和IFNJ基因（包含上游启动子Py）片 段切下，将其定向插人 FPV e载体 11 75中，得到转移狲 11 75HAIFN。在 11 75HAff：N中，HA基因和 IFN。11基因分别处于启动子 P7．5和 PWh的转录控制下， 且转录方向正好相对。在IFN－11基因3’端有一痘苗病毒转录终止子，可避免这两 个基?