肥胖是胰岛素抵抗的主要特征之一,糖脂代谢紊乱与胰岛素抵抗关系密切。肥胖的一个重要特征是过度的脂质在脂肪组织和其他器官的异位堆积。利拉鲁肽(liraglutide)是胰高糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)类似物,其减轻体重及改善胰岛素抵抗作用已被公认,减重及改善胰岛素抵抗的同时常伴血脂的改善,但具体机制尚不明确。近期研究表明腺苷酸环化酶3(adenylyl cyclase3,AC3)可能在体重调节中起关键作用,AC3基因敲除小鼠成年后出现肥胖,并伴随着血脂的升高、脂肪组织的增多及脂肪细胞体积的增大。我们前期研究证实利拉鲁肽可增加糖尿病小鼠肝脏AC3表达,AC3水平与体重、胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment of insulin resistance,HOMA-IR)呈负相关。利拉鲁肽可增加初诊肥胖及非肥胖糖尿病患者血清AC3水平,血清AC3与HOMA-IR呈负相关。因此我们推测GLP-1通过增加AC3表达进而影响脂肪代谢发挥改善胰岛素抵抗的作用。据此,本研究拟通过体内、体外实验观察利拉鲁肽对脂肪代谢通路的影响,分析AC3与胰岛素抵抗的关系。本研究将有助于阐明GLP-1类似物改善胰岛素抵抗的分子机制及AC3与胰岛素抵抗的关系,为缓解胰岛素抵抗提供新思路。第一部分利拉鲁肽对小鼠腺苷酸环化酶3的影响及其在胰岛素抵抗和肥胖中的作用目的:观察胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物利鲁肽对小鼠AC3及体重、糖脂代谢的影响,研究利拉鲁肽及AC3与胰岛素抵抗的关系。方法:选取雄性C57BL/6J小鼠。C57BL/6J小鼠随机分为2组(C57正常组、C57肥胖组),每组12只,肥胖组C57BL/6J小鼠给予高脂饲料喂养(含脂肪34.98g%和蛋白质26.2g%),正常组C57BL小鼠给予普通饲料喂养(含脂肪4.5g%和蛋白质14.5g%)。每周测量体重和尾静脉随机血糖。肥胖小鼠建模成功后即从第12周开始,正常组C57BL/6J小鼠和肥胖组C57BL/6J小鼠每组再随机分为2亚组(正常C57BL/6J小鼠+利拉鲁肽处理组、正常C57BL/6J小鼠+生理盐水处理组、肥胖C57BL/6J小鼠+利拉鲁肽处理组、肥胖C57BL/6J小鼠+生理盐水处理组),利拉鲁肽处理组给予利拉鲁肽100ug/kg,皮下注射,每日两次,生理盐水处理组给予等量生理盐水作为对照。每周测量体重和尾静脉随机血糖。进行8周后摘取眼球采内眦静脉血,迅速取出肝脏实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT q PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)技术分别检测肝组织AC3 m RNA和AC3蛋白的表达水平。静脉血离心取上清液ELISA法检测血清AC3、胰岛素、甘油三酯、甘油和游离脂肪酸水平。胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment of insulin resistance,HOMA-IR)评估胰岛素抵抗。结果:1.干预前肥胖组与正常组体重、血糖的比较:肥胖组体重显著高于正常组(P<0.01),肥胖组体重大于正常组体重20%以上;肥胖组血糖显著高于正常组(P<0.01),但肥胖组血糖未达到糖尿病诊断标准。2.干预后各组体重、血糖、胰岛素、HOMA-IR、甘油三酯、甘油、游离脂肪酸的比较:肥胖组体重明显高于正常组(P<0.01);利拉鲁肽能明显降低小鼠体重(P<0.01)。肥胖组血糖与正常组无显著性差异;利拉鲁肽对小鼠血糖无显著性影响。肥胖组胰岛素明显高于正常组(P<0.01);利拉鲁肽能明显降低小鼠胰岛素(P<0.01)。肥胖组HOMA-IR明显高于正常组(P<0.01);利拉鲁肽能明显降低小鼠HOMA-IR(P<0.01)。肥胖组甘油三酯、甘油、游离脂肪酸明显高于正常组(P<0.01);利拉鲁肽能明显降低小鼠甘油三酯、游离脂肪酸(P<0.01);利拉鲁肽能明显增加小鼠甘油水平(P<0.01)。利拉鲁肽对肥胖组体重、胰岛素、HOMA-IR、甘油三酯、甘油、游离脂肪酸的影响显著大于正常组(P<0.05)。3.干预后各组血清AC3的比较:肥胖组血清AC3明显低于正常组(P<0.01);利拉鲁肽明显增加小鼠血清AC3(P<0.01);利拉鲁肽增加肥胖组血清AC3的幅度显著高于正常组(P<0.05)。4.干预后各组小鼠肝脏AC3 m RNA表达的比较:肥胖组小鼠肝脏AC3 m RNA明显低于正常组(P<0.01);利拉鲁肽明显增加小鼠肝脏AC3m RNA(P<0.01);利拉鲁肽增加肥胖组小鼠肝脏AC3 m RNA的幅度显著高于正常组(P<0.05)。5.干预后各组小鼠肝脏AC3蛋白表达水平的比较:肥胖组小鼠肝脏AC3蛋白表达水平明显低于正常组(P<0.01);利拉鲁肽明显增加小鼠肝脏AC3蛋白表达水平(P<0.01)。利拉鲁肽增加肥胖组小鼠肝脏AC3蛋白水平的幅度显著高于正常组(P<0.05)。6.AC3与体重、HOMA-IR的关系:对血清AC3、肝脏AC3 m RNA、肝脏AC3蛋白水平与体重及HOMA-IR分别进行Pearson相关性分析发现血清AC3与体重呈负相关(r=-0.682,p=0.000),与HOMA-IR呈负相关(r=-0.716,p=0.000)。肝脏AC3m RNA水平与体重呈负相关(r=-0.441,p=0.031),与HOMA-IR呈负相关(r=-0.654,p=0.001)。肝脏AC3蛋白表达水平与体重呈负相关(r=-0.672,p=0.000),与HOMA-IR呈负相关(r=-0.665,p=0.000)。结论:利拉鲁肽可以减轻小鼠体重,降低胰岛素抵抗指数,降低甘油三酯及游离脂肪酸水平,增加甘油水平,促进脂肪分解。利拉鲁肽对肥胖小鼠的体重、胰岛素抵抗指数、甘油三酯、游离脂肪酸的降低幅度显著高于正常组小鼠。利拉鲁肽可以增加小鼠AC3的水平,利拉鲁肽对肥胖小鼠AC3增加的幅度显著高于正常小鼠。AC3水平与体重、H0MA-IR负相关。第二部分利拉鲁肽对AC3/c AMP/PKA/HSL脂肪代谢通路的影响目的:观察利拉鲁肽对小鼠肝组织及hepa1-6细胞AC3/c AMP/PKA/HSL脂肪代谢通路关键因子的影响。方法:1.动物实验:动物造模及药物干预同第一部分。干预8周后,迅速取出肝脏RT q PCR技术检测肝组织GLP-1R、AC3和HSL m RNA的表达和Western blot技术检测肝组织GLP-1R、AC3、HSL、激素敏感性脂肪酶660位丝氨酸磷酸化(phosphorylated HSL Ser-660,p-HSL(s660))蛋白的表达水平及c AMP水平。ELISA检测肝脏组织的PKA活性。2.细胞实验:用不同浓度的利拉鲁肽(0、100、200nmol/L)与肝癌hepa1-6细胞共同培养48h后抽提总RNA,RT q PCR技术检测细胞GLP-1R、AC3、HSL m RNA的表达和蛋白免疫印迹法Western blot技术检测细胞GLP-1R、AC3、HSL、p-HSL(s660)蛋白的表达水平及c AMP水平。ELISA检测细胞的PKA活性。结果:1.干预后各组小鼠肝脏GLP-1R、AC3和HSL m RNA表达的比较:肥胖组小鼠肝脏GLP-1R m RNA明显高于正常组(P<0.01);利拉鲁肽能明显增加小鼠肝脏GLP-1R m RNA(P<0.01);利拉鲁肽增加肥胖小鼠肝脏GLP-1R m RNA的幅度明显高于正常组(P<0.01)。肥胖组小鼠肝脏AC3m RNA明显低于正常组(P<0.01);利拉鲁肽能明显增加小鼠肝脏AC3m RNA(P<0.01);利拉鲁肽增加肥胖组小鼠肝脏AC3 m RNA的幅度显著高于正常组(P<0.05)。肥胖组与正常组肝脏HSL m RNA无显著性差异;利拉鲁肽对小鼠肝脏HSL m RNA无显著性影响。2.干预后各组小鼠肝脏GLP-1R、AC3、HSL、p-HSL(s660)蛋白表达水平及c AMP的比较:肥胖组小鼠肝脏GLP-1R蛋白表达水平明显高于正常组(P<0.01);利拉鲁肽能明显增加小鼠肝脏GLP-1R蛋白表达水平(P<0.01)。肥胖组小鼠肝脏AC3蛋白表达水平明显低于正常组(P<0.01);利拉鲁肽能明显增加小鼠肝脏AC3蛋白表达水平(P<0.01)。肥胖组与正常组肝脏HSL蛋白表达水平无显著性差异;利拉鲁肽对小鼠肝脏HSL蛋白表达水平无显著性影响。肥胖组小鼠肝脏p-HSL(s660)蛋白表达水平明显低于正常组(P<0.01);利拉鲁肽能明显增加小鼠肝脏p-HSL(s660)蛋白表达水平(P<0.01)。肥胖组小鼠肝脏c AMP水平明显低于正常组(P<0.01);利拉鲁肽能明显增加小鼠肝脏c AMP水平(P<0.01)。利拉鲁肽对肥胖组小鼠肝脏GLP-1R、AC3、p-HSL(s660)蛋白表达水平及c AMP水平的影响明显大于正常组(P<0.05)。3.干预后各组肝脏PKA活性的比较:肥胖组肝脏PKA活性明显低于正常组(P<0.01);利拉鲁肽能明显增加小鼠肝脏PKA活性(P<0.01);利拉鲁肽增加肥胖组肝脏PKA活性的幅度显著高于正常组(P<0.05)。4.细胞GLP-1R、AC3m RNA的表达水平随着利拉鲁肽浓度的增加而呈现增加的趋势;不同浓度的利拉鲁肽干预后细胞HSL m RNA的表达水平无显著性差异。细胞GLP-1R m RNA表达水平对利拉鲁肽呈浓度依赖性(r=0.843,p=0.004);细胞AC3 m RNA表达水平对利拉鲁肽呈浓度依赖性(r=0.843,p=0.004);细胞HSL m RNA表达水平对利拉鲁肽无浓度依赖性(r=0.632,p=0.068)。5.细胞GLP-1R、AC3、p-HSL蛋白的表达水平及c AMP水平随着利拉鲁肽浓度的增加而呈增加趋势。不同浓度的利拉鲁肽干预后细胞HSL蛋白的表达水平无显著性差异。细胞GLP-1R蛋白表达水平对利拉鲁肽呈浓度依赖性(r=0.791,p=0.011);细胞AC3蛋白表达水平对利拉鲁肽呈浓度依赖性(r=0.843,p=0.004);细胞HSL蛋白表达水平对利拉鲁肽无浓度依赖性(r=-0.264,p=0.493);细胞p-HSL(s660)蛋白表达水平对利拉鲁肽呈浓度依赖性(r=0.738,p=0.023);细胞c AMP水平对利拉鲁肽呈浓度依赖性(r=0.738,p=0.023)。6.细胞PKA活性随着利拉鲁肽浓度的增加而呈增加趋势。细胞PKA活性对利拉鲁肽呈浓度依赖性(r=0.843,p=0.004)。结论:利拉鲁肽可以上调小鼠肝脏AC3/c AMP/PKA/HSL通路的关键因子的表达水平、磷酸化程度或活性。利拉鲁肽对肥胖小鼠的AC3/c AMP/PKA/HSL通路的影响较正常小鼠明显。利拉鲁肽可以上调hepa1-6细胞AC3/c AMP/PKA/HSL通路的关键因子的表达水平、磷酸化程度或活性。