哺乳动物精液冷冻保存,在种质资源保存、优良公畜利用、养殖场生物安全和节约成本等方面越来越受到关注。近年来,在某些动物种类精液冷冻保存技术方案已取得了突破,这些方案在人、犬和牛上应用并获得良好的效果。然而,猪精液的冷冻保存应用效果仍不十分理想。因此,随着集约化、规模化养殖业的发展,建立有效的猪精液超低温冷冻保存方案就非常迫切。本文选择我国优良品种姜曲海猪,研究精液超低温冷冻保存后对存活和发育能力的影响,在建立冷冻方案的基础上,对姜曲海精子冷冻前后的酶活性、超微结构和差异蛋白进行研究,以阐明冷冻损伤机制;同时,进行了人工授精应用。主要内容包括以下5个部分:一、超低温冷冻对姜曲海猪精液品质的影响本研究主要进行了姜曲海猪精液品质评价方法与体外受精相关性的分析,冷冻精液保护剂的选择,冷冻与解冻方法对精液品质的影响。结果表明,①猪精子活力、PI染色、低渗肿胀试验、Rh123染色、FITC标记的PNA染色与体外受精均存在较强的线性相关性,以顶体完整率与体外受精率的相关程度最高。②在冷冻稀释液中添加终浓度为3%的二甲亚砜、丙二醇、乙二醇和甘油,甘油冷冻保护效果最好,且其活力、质膜破损率、顶体完整率和线粒体活性均与二甲亚砜(Dimethylsulphoxide,DMSO)冷冻组和丙二醇(Propanediol,PDO)冷冻组存在显著差异(P<0.05),但与乙二醇(Ethyleneglycol,EG)冷冻组均无显著差异存在(P>0.05)。③通过选择距离液氮面分别为2 cm、5 cm和9 cm高度进行熏蒸,发现以距离液氮面9 cm高度熏蒸效果最差,与2 cm和5cm高度熏蒸各试验指标均存在显著差异(P<0.05);距离液氮面2 cm和5 cm高度熏蒸效果相比,除5 cm高度熏蒸组顶体完整率显著高于2 cm高度熏蒸组外,二者活力、质膜破损率和线粒体活性间均无统计学意义(P>0.05)。④通过研究解冻方法对猪精液品质的影响,发现解冻时直接将0.25 mL细管置于37 ℃水浴30 s,其精子活力、顶体完整率、质膜完整率和体外受精胚胎发育率等各指标均显著优于后者。⑤在冷冻液中添加不同含量GSH和/或HA,发现添加GSH 5 mmol/L效果较好,除卵裂率指标外,活力、顶体完整率、超氧化物歧化酶活性以及丙二醛含量均与未添加组具有显著差异(P<0.05);而添加透明质酸则以900μg·mL-1添加浓度效果较好,除卵裂率与未添加HA组不存在显著差异外(P>0.05),其冻后活力、顶体完整率、SOD活性及MDA含量均与未添加HA组存在统计学差异(P<0.05)。联合添加GSH和HA,以添加GSH 5 mmol·L1和HA 900 μg·mL-1组效果较好,且其各指标与未添加GSH和HA组均存在显著差异(P<0.05)。说明,冷冻液中联合添加GSH 5 mmol·L-1和HA 900 μg·mL-1可有效改善猪精液冷冻效果。二、超低温冷冻对姜曲海猪精液酶活性的影响为了阐明姜曲海猪精液超低温冷冻-解冻后酶活性的变化,检测了新鲜和冷冻保存精液中抗氧化酶、功能性酶和代谢性酶的活性。结果表明,与新鲜精液相比,冷冻-解冻精液除GR活性显著升高外(P<0.05),其他酶活性均显著降低(P<0.05)。说明,超低温冷冻保存破坏了姜曲海猪精子酶系统,导致多数酶活性降低是影响其冷冻效果的原因之。三、超低温冷冻对姜曲海猪精液超微结构的影响本试验旨在研究姜曲海猪精子超低温保存前后的超微结构变化。扫描电镜和透射电镜观察结果表明,姜曲海猪精子全长约54.4 μm,由头、颈、体和尾4部分组成;形态结构正常的精子,表现为质膜、顶体和线粒体结构完整,顶体光滑,线粒体排列整齐,核染色质均匀;冻后精子表现为不同程度的损伤,主要为颈部断裂、膨胀,顶体表面粗糙或顶体缺失,质膜膨胀或缺失,线粒体移位。表明,超低温保存造成姜曲海猪精子超微结构的损伤主要集中于质膜、顶体和线粒体。四、姜曲海猪精液超低温保存前后差异蛋白质组学研究以冻融前后姜曲海猪精子为研究对象,采用双向电泳技术(Two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)分离获得表达不同的蛋白点,利用MALDITof/Tof质谱鉴定技术分析相关差异蛋白,并利用blast2go软件对差异蛋白质进行GO(gene ontology)功能注释。经蛋白图谱比较分析和质谱鉴定发现,冻融前后精子差异的蛋白点为42个,主要参与结合、催化活性、结构分子活性、分子功能调节、抗氧化活性、核酸结合转录因子和转运活性等7个生物学功能。结合GO分析和KEGG数据库进行蛋白信号通路分析,分析获得有意义差异蛋白15个,其中差异酶蛋白5种:类组氨酸磷酸酶14、烯醇酶、二氢硫辛酸脱氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和β-5型-蛋白酶体亚基,均表现下调;与受精相关的差异蛋白6种,分别为顶体结合蛋白、糖结合蛋白AQN-1前体、电压依赖阴离子选择通道蛋白2、类锌指蛋白420、乳凝集素前体、磷脂酰乙醇胺结合蛋白4,除糖结合蛋白AQN-1前体外,其余均表现下调;与细胞骨架相关的差异蛋白4个,分别为肌动蛋白成帽蛋白β亚基变异体Ⅱ、类胞质动力蛋白2重链1、β微管蛋白、外致密纤维蛋白2,除肌动蛋白成帽蛋白β亚基变异体Ⅱ外,也均表现下调。表明冻融影响姜曲海猪精子能量代谢、细胞骨架、受精和抗氧化能力,为进一步研究猪精子蛋白质组学及揭示精子冷冻损伤机制提供了依据。但差异蛋白质对精子功能和受精胚胎发育的影响还有待深入研究。五、冷冻姜曲海猪精液的人工授精应用为研究自制冷冻姜曲海猪精液的保存效果,采用常规输精和子宫内输精进行人工授精。结果表明,新鲜精液人工授精效果显著高于冷冻-解冻精液人工授精效果(P<0.05)。新鲜精液采用常规输精和子宫内输精,二者在受胎率、分娩率和窝均产仔数方面无显著差异(P>0.05)。冷冻-解冻精液采用常规输精和子宫内输精,二者受胎率和分娩率具有统计学差异(P<0.05),但窝均产仔数差异不显著(P>0.05)。