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一、研究背景骨关节炎（osteoarthritis,OA）是慢性退行性骨关节疾病,系由增龄、肥胖、劳损、创伤、关节先天性异常以及关节畸形等诸多因素引起的关节软骨的退化损伤,最终导致关节僵直畸形和功能障碍。随着人口老龄化加剧和肥胖人群比例增多,其发病率仍在逐年上升。关节软骨组织本身无血管结构,而且软骨细胞再生能力极弱,该病一旦发生即呈现进行性加重的临床特点。由于发病机制不明,目前尚无有效的预防和治疗方法。OA是一种慢性炎症,病变局部的微环境中多种因素参与软骨细胞的损伤,导致软骨细胞细胞外基质（extracellular matrix,ECM）与再生的组织重塑失衡。组织病理学改变为软骨细胞的变性坏死,坏死区血管化进而诱导骨化,使关节僵直变形。这一病变形成与进展过程中,巨噬细胞被认为是驱动因素。活化的巨噬细胞产生促炎介质以及多种能降解ECM的酶类,后者加剧炎症环境并进一步导致软骨细胞的破坏。然而,对巨噬细胞在软骨损伤及病变形成的分子机制所知甚少。随着干细胞与再生医学研究的深入,干细胞对于OA的治疗已经显示出良好的应用前景。其中不同来源的间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）在该病治疗效果,已经在多种动物实验和临床研究中得到肯定。特别是人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs）,由于其来源于废弃脐带组织,具有增殖能力强、免疫源性低等优势,因此倍受青睐。但干细胞治疗不能回避的安全性疑虑、保存运输的不便、非治疗目的分化等应用和科学问题,仍需深入探讨。同时,寻找一种作用效果好、安全性高、易采集、性质稳定的干细胞替代品成为该领域研究的热点。干细胞对疾病的治疗主要通过旁分泌的作用实现,特别是分泌物中的外泌体（exosomes,Exos）在这一过程中发挥重要的作用。Exos是细胞所分泌到细胞外的一种细胞外囊泡,包含多种核酸、蛋白质和脂质等,参与细胞与细胞之间的通信交流。与干细胞相比,Exos治疗时可对其剂量进行更精准的把控,在不同的病理生理条件下更加稳定,且Exos几乎不会引起机体免疫排斥反应。这些独特的优势使得干细胞的Exos成为了诸多科学研究与临床转化中的热点。在软骨修复方面,最近的研究表明干细胞的Exos可极大地增强软骨的修复能力并起到保护软骨的作用。例如:来自髌下脂肪垫MSCs的Exos可以保护软骨免受损伤,并改善OA小鼠的步态异常;胚胎MSCs的Exos通过平衡软骨细胞ECM的合成和降解,对OA小鼠具有一定的治疗作用;同时胚胎MSCs的Exos也具有免疫调节作用,在OA小鼠中减少M1型巨噬细胞的浸润,下调白细胞介素 1β（interleukin-1β,IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）的表达,可诱导M2型巨噬细胞浸润,修复OA软骨缺损和滑膜损伤,从而抑制OA的炎症反应。Exos含有多种生物活性物质,主要由蛋白质、核酸和脂类等组成。Exos中核酸的种类繁多,包括基因组和线粒体的DNA,以及RNA（mRNA、microRNA、lncRNA、cirRNA 等）。microRNA（miRNA）作为一类极其重要的核酸类物质,具有重要的生物学功能,能通过参与转录、转录后加工和蛋白质的翻译、修饰等对靶细胞基因的表达和功能进行调节。MSCs源性Exos中含有多种miRNA,这些miRNA可能促进细胞间的通讯,并有助于组织愈合。其中许多miRNA参与信号转导、软骨代谢和关节炎进展。人骨髓MSCs来源的Exos中miR-26a-5p通过促进关节的滑膜成纤维细胞的增殖和迁移,抑制凋亡进而减缓关节的炎症。髌下脂肪MSCs来源的Exos中miR-100-5p通过调节mTOR信号通路促进软骨细胞的自噬。研究表明软骨细胞的自噬增加Ⅱ型胶原（type Ⅱ collagen,COL2A1）和蛋白聚糖（aggrecan,ACAN）的表达,同时降低了损伤的软骨细胞中ECM降解酶如基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）13和血小板反应蛋白重组解整合素金属肽酶（recombinant a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin,AD AMTS）5 的表达水平。二、研究目的本文拟通过大鼠膝关节OA体内实验和IL-1β诱导OA软骨细胞模型体外实验,观察hUC-MSCs-Exos对OA治疗作用;研究hUC-MSCs-Exos对M0和M1型巨噬细胞极化影响;应用测序技术结合生物信息学分析探究hUC-MSCs-Exos抑制软骨细胞损伤的作用机理,为骨关节炎的基础研究提供了新的思路,为临床治疗提供新的策略。三、研究方法1.培养与鉴定hUC-MSCs分离脐带华通胶,进行组织块培养7～10天,长出长梭样细胞,应用免疫荧光和流式细胞术鉴定间充质干细胞标志物的表达,定向诱导检测细胞的多向分化能力,鉴定hUC-MSCs。2.提取与鉴定hUC-MSCs-Exos采用差速超速离心法从hUC-MSCs培养上清中获取hUC-MSCs-Exos,通过透射电镜、粒径分析仪鉴定其形状及粒径大小。采用流式细胞术和蛋白质免疫印迹法（western blot,WB）鉴定其标志物的表达情况,为后续实验提供充足的hUC-MSCs-Exos。3.观察分析hUC-MSCs-Exos对大鼠OA的治疗作用前交叉韧带横断联合内侧半月板切除术（anterior cruciate ligament transection combined with medial meniscectomy,ACLT+pMMx）建立大鼠 OA 模型,建模4周后,关节腔内注射hUC-MSCs-Exos,每周2次,连续4周进行治疗。开展大鼠膝关节病理切片HE、番红-O固绿染色,观察关节面软骨损伤修复情况,开展免疫组织化学染色鉴定软骨细胞、巨噬细胞标志物的表达情况,评价hUC-MSCs-Exos治疗大鼠OA的效果。4.分析hUC-MSCs-Exos对巨噬细胞极化影响hUC-MSCs-Exos作用M0和M1型巨噬细胞,应用定量实时聚合酶链反应（RT-qPCR）检测其促炎因子及抗炎因子基因表达水平。采用免疫荧光分析hUC-MSCs-Exos作用M0和M1型巨噬细胞后M1和M2型巨噬细胞标志物的表达情况,探究hUC-MSCs-Exos对巨噬细胞极化的影响。5.构建M1型巨噬细胞和软骨细胞共培养体系,分析hUC-MSCs-Exos对共培养体系细胞的影响建立巨噬细胞和软骨细胞共培养体系,通过RT-qPCR和免疫荧光检测软骨细胞ECM标志物及ECM分解酶标志物基因和蛋白表达水平。采用TUNEL染色分析软骨细胞凋亡的情况,研究经hUC-MSCs-Exos处理M1型巨噬细胞对软骨细胞的影响。6.分析hUC-MSCs-Exos对软骨细胞的生物学行为的影响采用CCK-8和EdU染色评估hUC-MSCs-Exos对软骨细胞增殖的作用,使用transwell细胞迁移实验检测hUC-MSCs-Exos对软骨细胞迁移的影响,应用Annexin V-FITC/PI染色研究hUC-MSCs-Exos对凋亡的软骨细胞作用。7.检测hUC-MSCs-Exos对OA软骨细胞模型的作用10ng/mL IL-1β诱导软骨细胞24h,复制OA软骨细胞模型,给予hUC-MSCs-Exos作用72小时后,通过RT-qPCR、免疫荧光和WB检测软骨细胞ECM标志物及ECM分解酶标志物基因和蛋白表达水平。8.高通量测序结合生物信息学分析,探讨作用机制采用高通量测序技术对hUC-MSCs-Exos的miRNA进行分析,同时对正常软骨细胞、OA模型的软骨细胞以及hUC-MSCs-Exos处理OA模型软骨细胞转录组进行分析。RT-qPCR实验对生物信息学筛选的差异表达基因进行验证,通过数据库筛选miR-100-5P可能的结合位点,并通过双荧光素酶报告实验进行验证。分析hUC-MSCs-Exos作用OA模型的软骨细胞可能作用机制,并经WB进行初步验证。三、研究结果1.成功分离获得 hUC-MSCs 及 hUC-MSCs-Exos组织块培养法培养脐带华通胶组织,成功获得hUC-MSCs。hUC-MSCs高表达间充质干细胞的标志物CD44、CD73、CD90、CD105,可定向诱导向软骨细胞、骨细胞和脂肪细胞方向分化。采用差速超速离心法,每毫升hUC-MSCs培养上清液可分离5.2×108个hUC-MSCs-Exos。超微结构显示hUC-MSCs-Exos呈球状,具有典型的双层膜结构,直径约为30～150nm。hUC-MSCs-Exos表达Exos标志蛋白CD63、CD81。上述结果表明hUC-MSCs-Exos可以被大量获取,以支撑本实验的后续研究。2.成功复制大鼠OA模型及证明hUC-MSCs-Exos对大鼠OA膝关节软骨的保护作用ACLT+pMMx诱导大鼠OA模型,病理学观察所见,实验动物膝关节腔隙变窄,关节面粗糙。关节软骨呈现均质粉染,软骨膜下骨小梁排列紊乱,关节面软骨细胞外基质部分丢失。免疫组化染色结果显示关节面软骨细胞COL2A1阳性表达的细胞数减少,而MMP13阳性表达的细胞增多。以上结果表明成功复制了人类OA的动物模型。经hUC-MSCs-Exos治疗后大鼠OA,病理学观察所见,关节软骨面光滑,软骨组织结构完整,关节腔隙接近正常,骨小梁排列规则,软骨细胞外基质染色均匀一致。与OA模型组相比,国际OA研究学会（osteoarthritis research society international,OARSI）评分降低。免疫组化染色结果显示关节面软骨细胞COL2A1阳性表达的细胞数增加,而MMP13阳性表达的细胞减少,关节软骨下骨髓腔中的CD86阳性表达M1型巨噬细胞数量减少,CD163阳性M2型巨噬细胞明显增多。结果表明hUC-MSCs-Exos对大鼠OA模型膝关节软骨具有保护作用和抗炎效果。3.证明hUC-MSCs-Exos调节巨噬细胞极化用hUC-MSCs-Exos处理M0和M1型巨噬细胞,抗炎因子白介素-10（interleukin-10,IL-10）和精氨酸酶 1（arginasel,ARGI）的 mRNA表达水平升高,而促炎因子IL-1β和TNF-α的mRNA表达水平降低,CD163阳性M2型巨噬细胞数量增加,CD86阳性M1型巨噬细胞数量减少,表明hUC-MSCs-Exos对巨噬细胞极化具有调节作用。4.证明hUC-MSCs-Exos抑制M1型巨噬细胞对软骨细胞损伤作用建立M1型巨噬细胞和软骨细胞共培养体系,上层小室M1型巨噬细胞加入hUC-MSCs-Exos后,与未经处理的M1型巨噬细胞相比,促炎因子IL-1β、TNF-α的mRNA表达下调,抗炎因子IL-10、ARG1的mRNA表达上调。小室下层与hUC-MSCs-Exos处理的M1型巨噬细胞共培养的软骨细胞,相比与未经处理的M1型巨噬细胞共培养的软骨细胞,软骨细胞ECM标志物CO2A1的mRNA、蛋白表达上调,软骨细胞ECM分解酶标志物MMP13的mRNA、蛋白表达下调。M1型巨噬细胞能够诱导软骨细胞的凋亡,但当加入hUC-MSCs-Exos后,凋亡细胞数量显著减少。证明hUC-MSCs-Exos对M1型巨噬细胞诱导的软骨细胞损伤、凋亡具有保护作用。5.证明hUC-MSCs-Exos促进软骨细胞增殖、迁移,抑制软骨细胞凋亡CCK-8结果显示0.5、1、2和4×107个/mL浓度的hUC-MSCs-Exos均可促进软骨细胞增殖,并且呈剂量依赖效应。hUC-MSCs-Exos处理软骨细胞的EdU染色阳性细胞数量明显高于对照组。Transwell实验结果表明,与对照组相比,加入hUC-MSCs-Exos的软骨细胞迁移的数量明显增多。Annexin V-FITC/PI染色结果显示相对于模型组,加入hUC-MSCs-Exos凋亡的软骨细胞数量明显减少。表明hUC-MSCs-Exos对软骨细胞增殖、迁移有促进作用,对软骨细胞凋亡有抑制作用。6.证明hUC-MSCs-Exos抑制IL-1β诱导的软骨细胞损伤RT-qPCR、免疫荧光和WB检测结果显示IL-1β诱导软骨细胞损伤的体外细胞OA模型中,软骨细胞ECM的标志COL2A1和ACAN的mRNA和蛋白表达水平降低,软骨细胞关键转录因子SOX9的mRNA和蛋白表达水平降低,软骨细胞ECM分解酶标志物MMP13和ADAMTS5的mRNA和蛋白表达水平上调,软骨细胞骨化标志物COL1A2的mRNA和蛋白表达水平上调。OA模型软骨细胞加入hUC-MSCs-Exos培养,相对于OA模型组,COL2A1、ACAN和SOX9的mRNA和蛋白表达水平升高,MMP13、ADAMTS5和COL1A2的mRNA和蛋白表达水平下调。表明hUC-MSCs-Exos促进OA模型软骨细胞ECM合成,抑制其分解。7.初步阐明hUC-MSCs-Exos通过miR-100-5p靶向调控FGFR3发挥作用通过高通量测序结合生物信息学分析筛选出可能被hUC-MSCs-Exos的miRNA调控的5个基因,通过RT-qPCR进行验证,5个基因的表达趋势与测序结果一致。选取差异表达最明显的FGFR3基因进行研究,预测结果显示FGFR3与hUC-MSCs-Exos高丰度表达miR-100-5p之间有结合位点。WB结果显示hUC-MSCs-Exos处理的OA模型软骨细胞相对于OA模型组,FGFR3,p-PI3K,p-mTOR蛋白表达水平下调。表明hUC-MSCs-Exos抑制IL-1β对软骨细胞损伤,可能机制是通过miR-100-5p靶向调控FGFR3/PI3K/mTOR信号轴发挥作用。四、研究结论1.hUC-MSCs生长旺盛,经多次传代冻存和复苏后、仍能保持增殖活力,且无分化现象。收集hUC-MSCs培养上清液,大量获取的hUC-MSCs-Exos,对包括OA在内的许多疾病的治疗提供丰富的Exos来源。2.ACLT+pMMx诱导大鼠OA模型,再现了人类OA所见的病理学改变。hUC-MSCs-Exos对大鼠OA模型进行治疗,显示Exos对膝关节软骨具有明显的保护作用。3.hUC-MSCs-Exos对软骨细胞损伤的保护效果,是通过调节巨噬细胞的极化,抑制M1型巨噬细胞对软骨细胞的损伤及凋亡发挥作用。4.hUC-MSCs-Exos促进软骨细胞增殖、迁移、抑制其凋亡,抑制IL-1β对软骨细胞损伤,其机制可能是通过miR-100-5p靶向调控FGFR3/PI3K/mTOR信号轴发挥作用。