COX-2通路中PGE2-EP4对口腔鳞状细胞癌生物学特性的作用及机制

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口腔鳞状细胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC)是临床上常见的恶性肿瘤之一,其发病率在全球呈现逐年上升的趋势。在过去的20年中,尽管针对OSCC的治疗方法不断发展,但OSCC的五年生存率无明显改善,因此发病机制、诊断及治疗仍是OSCC的研究热点。近年来,肿瘤微环境中炎症与恶性肿瘤关系的研究备受关注,尤其是环氧化酶(Cyclooxygenase,COX)通路在介导炎症和癌症关系中的作用值得深入探究。研究表明,COX-2过表达与口腔癌的发生、侵袭以及化疗药物的耐药性相关,而针对COX-2的非类固醇消炎药(Nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)可以抑制恶性肿瘤的发生发展,但它的长期使用会产生诸多副作用如胃溃疡和心肌梗死等,临床应用受限。前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)是COX-2通路的下游产物。研究表明,PGE2能促进多种恶性肿瘤的增殖及侵袭,其机制可能为抑制局部免疫反应。然而,PGE2及其受体4亚型(E-prostaglandin,EP4)对OSCC生物学特性的影响及机制尚未完全明了。为此,我们通过在OSCC细胞株中外源性添加PGE2及相应的拮抗剂来研究PGE2对OSCC细胞增殖及凋亡的影响并探讨其可能的机制,从而寻找OSCC治疗的潜在靶点。(1)我们采用cellcounting kit 8(CCK8)法检测外源源性PGE2对OSCC细胞株Tca8113增殖活性的影响,发现在作用48 h时,PGE2能显著地促进细胞增殖,效应呈现剂量依赖趋势,且在PGE2浓度为1.0μmol/L时出现峰值。(2)采取Western-blot(WB)的方法研究PGE2促Tca8113细胞增殖的作用机制,我们发现,外源性添加PGE2可激活ERK的磷酸化,而磷酸化过程可被MEK的抑制剂U0126拮抗;通过CCK8检测Tca8113细胞增殖,我们发现,外源性的U0126能拮抗PGE2对Tca8113细胞增殖的促进作用;上述结果表明PGE2可通过激活ERK的磷酸化促进Tca8113细胞的增殖。(3)WB法检测显示,4种类型的EP受体在Tca8113细胞中均有表达。(4)为确定与PGE2结合的EP受体类型,我们分别加入EP1、EP2及EP4受体拮抗剂,结果表明,EP4拮抗剂L-161,982可拮抗PGE2对Tca8113细胞的增殖作用,并呈现剂量和时间依赖性;进一步采用WB法检测,我们发现,L-161,982通过抑制PGE2对ERK磷酸化的促进作用,从而发挥拮抗作用,这也同样验证了 PGE2是通过激活ERK的磷酸化来促进细胞增殖。(5)为了进一步验证PGE 2是否通过结合受体EP4而起作用,我们在细胞中加入3种类型的EP受体激动剂,结果发现,仅有EP4激动剂PGE1-OH可以恢复被塞来昔布预处理的Tca8113细胞的增殖,并具有浓度依赖性趋势;进一步采用WB法,我们发现,PGE1-OH通过激活ERK磷酸化来促进细胞增殖,而MEK的抑制剂U0126可抑制此作用,提示PGE2可能通过结合受体EP4来促进细胞增殖的。(6)流式细胞仪检测显示,L-161,982可以诱导Tca8113细胞凋亡,并通过阻断s期来影响细胞周期,其作用具有浓度依赖趋势;WB法进一步检测发现,L-161,982通过上调Bax和下调Bcl-2蛋白水平来诱导细胞凋亡,同时通过上调P21和下调CDK2及CyclinA2的蛋白表达影响细胞周期。综上所述,本研究发现PGE2可通过结合受体EP4来介导ERK磷酸化诱导的细胞增殖,并影响细胞凋亡及周期,因此,EP4受体可能成为OSCC的治疗靶点。
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