小麦多酚氧化酶基因克隆分析及其分子标记开发

来源 :河南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xumeg
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面粉及其面制品色泽是评价小麦品质性状的最重要指标之一,小麦籽粒中多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)是导致其褐变的主要原因。褐变不仅影响面粉及其面制品的表观品质,也会造成食品特性和营养价值的缺失。因此,对小麦中多酚氧化酶的分子遗传特性,以及其与小麦色泽品质性状之间的关系进行研究,既能为我国小麦品质性状的改良提供参考和理论依据,也在我国粮食安全和经济发展等方面具有重大的现实意义。本研究以我国地方农家种群体211份小麦品种为材料,用L-DOPA的方法测定其籽粒的PPO活性并进行聚类分析,运用小麦A、B、D染色体组不同的分子标记,对参试材料进行了多酚氧化酶基因的分子检测,分析研究了不同基因类型的分布和其与PPO活性之间的关系。通过同源克隆的方法,对2BL染色体上的PPO基因进行克隆和生物信息学分析,开发了2BL染色体上PPO活性的分子标记并进行验证,主要结果如下:1.我国地方农家种群体籽粒PPO活性总体均值为29.06 AU·min-1·g-1,变幅在9.23AU·min-1·g-157.34 AU·min-1·g-1,PPO活性变异范围广泛,具备较大的遗传改良的潜质,通过聚类分析对PPO活性进行了归类,分为低(<17 AU·min-1·g-1)、较低(1727 AU·min-1·g-1)、中间(2735 AU·min-1·g-1)、较高(3643 AU·min-1·g-1)、高(>43 AU·min-1·g-1)五个区间。参试材料PPO活性在五个区间整体呈正态分布,较低活性类型区间的材料最多,为58份,占27.5%2.我国地方农家种群体中,Ppo-A1b(低PPO活性类型)、Ppo-B1a(低PPO活性类型)和Ppo-D1b(高PPO活性类型)基因型分布频率较高,分别为73.9%、81.5%和63.2%。Ppo-A1a基因型活性均值为40.5 AU·min-1·g-1显著高于其他类型,Ppo-D1a基因型活性均值最低,为20.2 AU·min-1·g-1。分别用A、B、D染色体分子标记对活性区间的分布进行分析,结果表明PPO活性越高Ppo-A1a和Ppo-D1b类型出现的可能性越大,PPO活性越低Ppo-A1b和Ppo-D1a出现的可能性越大,B组染色体F-8扩增类型的分布没有明显的趋势。3.参试211份农家种材料中,中间活性区间的Ppo-A1b/Ppo-B1b/Ppo-D1a(31.86AU·min-1·g-1)基因型材料最多,频率为39.3%,高活性区间的Ppo-A1a/Ppo-B1a/Ppo-D1b(45.92 AU·min-1·g-1)和Ppo-A1a/Ppo-B1b/Ppo-D1b(43.06AU·min-1·g-1)基因型频率分别为1%和13.4%,低活性区间的Ppo-A1b/Ppo-B1a/Ppo-D1a(15.32AU·min-1·g-1)和Ppo-A1b/Ppo-B1b/Ppo-D1a(15.81AU·min-1·g-1)基因型频率分别为6.5%和22.9%。相同基因组合的材料仍有部分出现活性偏离,从不同分子标记组合来看PPO18、PPO16和PPO29效应显著,F-8效应有限,A、B、D三组染色体分子标记结合使用能增加选择的区分度和效率。4.利用同源克隆的方法克隆了普通小麦2BL染色体上一个PPO同源基因,其gDNA序列为1824bp,c DNA序列为1575bp,编码524个氨基酸,分子量为58.58 kD,等电点pI为6.58。用生物信息学的方法进行分析预测得知,其具有三个保守结构域,分别为Tyrosinase、PPO1DWL和PPO1KFDV,为亲水性蛋白,没有信号肽,不具备跨膜结构,有18处丝氨酸(Ser)磷酸化位点,17处苏氨酸(Thr)磷酸化位点和3处酪氨酸(Tyr)磷酸化位点。5.开发了2BL染色体PPO活性分子标记PPO-B5,能扩增出三个条带(a带、b带、c带),共有四种不同类型,分别命名为A类型(a带、b带、c带)活性均值为29.75 AU·min-1·g-1、B类型(b带、c带)活性均值为27.16 AU·min-1·g-1、C类型(a带、c带)活性均值为34.39AU·min-1·g-1、D类型(c带)活性均值为23.78 AU·min-1·g-1,四种类型在(P<0.05)水平差异显著。序列分析表明a带为431bp,与GQ30713.1相似度为99%,b带为230bp,与AB254804.1相似度为99%,序列差异发生在AB254804.1第二内含子的201bp缺失和12个SNP,c带为192bp,其来自于A组染色体。结合A、D组染色体分子标记PPO18、PPO16和PPO29对其进行验证,211份农家种材料中,HAHBHD类型(HA、HB、HD分别表示PPO18、PPO-B5、PPO16扩增出的高活性带型)活性最高,活性均值为43.67 AU·min-1·g-1,显著高于其他类型材料,LALBLD类型(LA、LB、LD分别表示PPO18、PPO-B5、PPO16扩增出的低活性带型)活性最低,活性均值为15.33 AU·min-1·g-1,三组分子标记组合使用能更精确区分不同活性的小麦品种,PPO-B5是可靠、实用的PPO活性分子标记。
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