人溶菌酶(human lysozyme,hLY)是人体液和组织中一种重要的防御因子,它具有抗菌、消炎、促进组织修复和增强免疫力等多种药理作用。在医学临床中,人溶菌酶生物源性和蛋白质本身特点使得其在低毒性和抗耐药性等方面更显优势,为临床用药提供了新的选择。由于人溶菌酶只能从乳汁、胎盘等体液和组织中少量提取,而且分离纯化成本较高,无法进行大规模生产。因而人溶菌酶的广泛应用只能通过生物技术手段才得以实现。目前国内外研究工作者已经利用多种表达载体在不同的宿主细胞中表达人溶菌酶,其中以大肠杆菌和毕赤酵母表达系统研究最多。为了平衡人溶菌酶分子的正电荷,降低其对宿主细胞的毒性,本研究拟将其分别与阴离子肽(AP)以及木聚糖酶(Xyn)融合,中间插入肠激酶位点(EKsite)或者柔性的连接肽(Linker),使表达的融合蛋白起始以无活性或弱活性形式分泌到毕赤酵母胞外,再在体外经肠激酶酶切释放出具有生物活性的人溶菌酶和木聚糖酶。研究结果如下：①选取人p防御素-25原片段的部分序列作为阴离子肽,根据毕赤酵母偏爱密码子设计并合成该段基因,设计时在基因中引入了His-tag和肠激酶酶切位点。构建了阴离子肽-人溶菌酶融合基因的真核表达载体,在毕赤酵母中进行分泌表达。然而经蛋白质电泳分析结果发现,重组菌表达的蛋白分子量约为38.1 kD,远高于理论值21.7 kD；②设计特定的引物序列将木聚糖酶和人溶菌酶基因相连接,中间分别插入肠激酶酶切位点和柔性的连接肽,构建了木聚糖酶-EKsite-人溶菌酶以及木聚糖酶-Linker-人溶菌酶融合基因,并在毕赤酵母中表达。蛋白质电泳结果显示,重组蛋白得到了表达；采用改良舒加法和DNS法分别测定发酵液上清的溶菌酶活性和木聚糖酶活性,其中木聚糖酶-Linker-人溶菌酶融合蛋白的溶菌酶活性为180 U/mL,略高于木聚糖酶-EKsite-人溶菌酶融合蛋白170 U/mL；木聚糖酶活性则相反,分别为158 U/mL和185U/mL。经超滤浓缩、Sephadex G-75凝胶层析分离纯化,得到了纯化的人溶菌酶融合蛋白。③木聚糖酶-EKsite-人溶菌酶融合蛋白经过肠激酶酶切回收并分析产物活性,结果表明,酶切产物的溶菌酶活性为520 U/mL,而木聚糖酶的活性为244 U/mL,与酶切前活性相比都有较大提高。