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目的:用免疫组化法检测T6-17细胞膜表面肿瘤标志物P185蛋白的表达量和分布情况,再从细胞上清中纯化P185蛋白作为阳性对照,将BAS和蛋白芯片技术结合,建立卵巢癌患者血清中肿瘤抗原P185蛋白的检测方法。
方法:六孔板中内置多聚赖氨酸处理过的盖玻片,加入T6-17细胞培养制备成细胞爬片,4%甲醛固定,0.1% TritonX-100工作液处理增加通透性,PBS洗涤后用免疫组化SP法处理,DAB显色并与石蜡切片免疫组化结果比较。采用溴化氰活化的Sepharose 4B为基质,通过交联A18 mAb,用亲和层析的技术纯化p185蛋白作为阳性对照。自制单克隆抗体A18为一抗,生物素化单克隆抗体Bio-A21为二抗,金基底芯片为载体,荧光物质Cy3为标记,经抗原抗体反应后,GenePix4100A芯片扫描仪扫描读数,根据荧光值摸索最佳反应条件,确定P185蛋白在卵巢癌中的阳性率,并与BA-Elisa结果进行比较。
结果:免疫组化结果显示P185蛋白主要分布于细胞膜上。从转基因细胞上清中成功获取肿瘤抗原P185蛋白。联合BAS的蛋白芯片的检测效率提高5倍左右,该检测方法的最佳反应条件是包被浓度6.25μg/ml,37°C孵育4h,样品缓冲液选择1%BSA-PBS。卵巢癌患者血清中P185阳性率为15.4%~18.5%,与BA-Elisa的结果一致。
结论:证实T6-17细胞膜表面表达P185蛋白,初步建立了BAS的抗体芯片检测方法。证实P185蛋白阳性率与卵巢癌发展有关,具有广阔的临床应用前景。