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谷胱甘肽是生物体内的非蛋白巯基类化合物,具有重要的生理功能,如抗氧化、解毒等功能,并在蛋白修复与合成、DNA合成和氨基酸转运方面也起着重要作用,已被广泛应用于医药、食品、化妆品等行业。本研究的主要内容是克隆表达多种来源的新型双功能谷胱甘肽合成酶,进行相关酶学性质的研究,并构建基因工程菌高产谷胱甘肽。分别克隆获得Actinobacillus succinogenes, Actinobacillus pleuropneumoniae和Streptococcus thermophilus中编码新型双功能谷胱甘肽合成酶(GshFAS、GshFAP. GshFST)的基因。以GshFAS、GshFAP、GshFST蛋白序列为标准序列,在蛋白数据库中Blast得到42条与GshF相似度极高的蛋白序列,发现含有此类似序列的菌株既有G～+细菌,也有G～.菌,且大部分属于厚壁菌门和r-变形菌门。根据不同来源的GshFs蛋白序列建立同源关系树,发现同源树由五个小蛋白簇组成,分别命名为链球菌属蛋白簇、乳酸菌菌属蛋白簇、r-变形菌门蛋白簇和另外两个杂蛋白簇。通过与已报道GshFs和Escherichia coli来源的r-谷氨酰半胱氨酸合成酶蛋白序列及二级结构比对,发现主要底物结合位点高度保守。构建了重组E. coliBL-21/pET-28a-gshFst、BL-21pET-28a-gshFap和BL-21/pET-28a-gshFas,三个酶都实现了高效活性表达,其中GshFAS表达量最高,达到总菌体蛋白量的20%。对重组纯酶进行动力学研究,发现GshFs中GshFAS酶比活最高；GshFs对GSH的Ki值远远大于E. coli中y-GCS对GSH的Ki值；GshFAS、GshFAP与GshFPM (Pasteurella multocida)的酶学性质相似,GshFST和GshFSA (Streptococcus agalatiae)的酶学性质相似。此外,pH和温度对三种GshFs酶活力都有较大影响,反应最适温度和最佳pH分别为40℃和9.0。重组E. coli可在不同底物浓度下催化合成GSH,在限制性底物浓度条件下,反应1.5h时GSH达到最高产量,GSH对ATP的得率都高于理论值；在高底物浓度下合成GSH, BL-21/pET-28agshFap产量最高,为36.6mmol/L,但ATP转化率有所降低。高浓度的初始ATP和Cys会影响重组细胞的催化活力,降低初始反应速率。其中重组菌BL-21/pET-28a-gshFap受Cys和ATP影响最明显。葡萄糖可代替ATP供给GSH合成,产量为6.5mmol/L。构建了表达GshFST的重组Pichia pastoris GS115,但GshFST表达量较低,摇瓶发酵过程中添加Cys,发酵96h,重组GS115/pGAPZA-gshFst的GSH产量是宿主菌GSll5的2.23倍。