目的：　　 已有研究发现全身麻醉药可引起发育期中枢神经细胞的损伤同时伴有神经功能的改变,最近研究发现突触发生期给予NMDA受体阻断剂会引起未成熟大鼠脑部神经元的广泛的凋亡。研究表明,在脑的生长爆发期(人妊娠后3月至出生后最初几年),CNS易受外界刺激干扰,在成年期表现出个体神经精神行为的异常。目前的研究从神经行为学和免疫组织化学证实麻醉药可引起神经元及突触和相应受体可塑性变化。这些研究引起了对目前使用的麻醉药的潜在危险的关注。异氟烷和七氟烷是目前广泛应用于儿科和产科手术的吸入麻醉药,均为NMDAR阻断剂,它们的应用是否会引起上述潜在的危险?母体妊娠前后吸入异氟烷、七氟烷是否影响婴幼儿神经元生长、分化、成熟等一系列环节的某个(某些)过程,从而产生远期可塑性的变化,进而影响智力发育是需深入研究的重要课题。　　 材料与方法：　　 实验动物:雌性SD大鼠3月龄,体重250g左右。雄性SD大鼠体重450-500g。由中国医科大学实验动物中心提供。实验前观察一周证实均健康。动物在22-23℃环境中自由活动,12:12小时日夜循环,自由进食水。仔鼠出生当天被定义为出生后0天。　　 实验一:雌性SD大鼠随机分为五组:对照组(C组),孕前暴露于异氟烷组(BI组),孕期暴露于异氟烷组(PI组),孕前暴露于七氟烷组(BS组),孕期暴露于七氟烷组(PS组)。C组,PI组,PS组于孕前在22-23℃环境中自由活动,12:12小时日夜循环,自由进食水,各组雌鼠分别以雌雄2:1比例与雄鼠合笼过夜。BI,BS组分别于孕前吸入1MAC异氟烷(1.5％)和七氟烷(2.4％)六小时,于100％纯氧中复苏后,各组雌鼠分别于当晚以雌雄2:1比例与雄鼠合笼过夜。各组雌鼠于次日清晨8时检查阴道涂片,以涂片查到精子定为孕0天。确定为怀孕的雌鼠单独分笼喂养。各实验组包含至少6只孕鼠,孕鼠孕期的常规健康情况被监测。孕鼠每胎产仔鼠8-12只,分娩后,体重较低的仔鼠被淘汰,保持每只雌鼠哺育8只仔鼠,仔鼠于生后21天断奶。PI组和PS组雌鼠在确定妊娠后,于妊娠6、10、14和18天分别吸入1MAC的异氟烷和七氟烷。本实验所用的出生0天,7天的大鼠相当于新生儿期,出生14天与28天的仔鼠相当于儿童期和青年期。各组吸入异氟烷或七氟烷的具体过程如下:50×40×40cm密闭麻醉箱,有三个开口,箱底铺一层1 cm厚的钠石灰,箱子前部一开口接螺纹管,另一开口接麻醉气体分析仪(Datex Ultima,Helsinki,Finland)和电动排风扇(流量为2L/Min)、后部开口接通大气塑料管。异、七氟烷与100％纯氧一起湿化后被送入箱内,大鼠保持自主呼吸,氧气流量为2L/Min。各组均吸入六小时,麻醉箱内每次放入大鼠数量不超过六只。各组于上午9点至12点吸入1.5％异氟烷,2.4％七氟烷3小时,为避免大鼠连续吸入出现缺氧和二氧化碳潴留现象,大鼠在100％纯氧中复苏后,于下午14点至17点再吸入1.5％异氟烷,2.4％七氟烷3小时结束。当箱内气体达到初始平衡后(异氟烷浓度达到1.5％,七氟烷浓度达到2.4％,氧气浓度达到96％以上),雌鼠被放入麻醉箱,雌鼠呼出气体浓度和麻醉药浓度被持续监测。以温度计持续监测肛温,并保持体温在37-38℃。麻醉结束后,停止麻醉给药,从麻醉箱中取出雌鼠,左心室穿刺取动脉血0.3ml做血气分析,然后使其在100％纯氧中复苏。在此期间,大鼠未见明显的呼吸抑制,并且所有鼠复苏后均未见明显的不良反应。Caspase-3检测各组P0、P7、P14、P28天子代大鼠海马神经细胞的凋亡。HE染色观察仔鼠海马组织病理变化。电镜观察海马超微结构的变化。免疫组化方法检测海马组织GAP-43及nNOS的表达。以胞浆中出现棕黄色颗粒为caspase-3,GAP-43及nNOS表达阳性结果。　　 实验二:免疫荧光和RT-PCR检测C组、BI组、BS组、PI组、PS组P0、P7、P14、P28子代大鼠海马NMDAR(NR1、NR2A、NR2B)的表达。　　 实验三:western-blot检测C组、BI组、BS组、PI组、PS组P0、P7、P14、P28天子代大鼠海马PKCα、p-JNK、p-ERK1/2、及Fos蛋白的表达。统计分析:采用SPSS13.0软件,所有数据以均数±标准差(-x±s)表示,实验组与对照组之间差异用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。　　 结果：　　 实验一:血气分析结果表明,大鼠在麻醉药吸入期间,PH,PaCO2,PaO2,HCO3-,SO2,均在正常范围内,组间比较未见明显差异。母体孕前暴露于异氟烷或七氟烷的子代大鼠海马caspase-3的表达与对照组相比无明显差异。母体孕期暴露于异氟烷或七氟烷的P0,P7,P14子代大鼠海马caspase-3表达与对照组相比表达显著增强(P＜0.01),PI组较PS组显著增强(P＜0.01),P28组表达与对照组相比未见明显差异。母体孕前暴露于异氟烷或七氟烷的子代大鼠海马GAP-43的表达与对照组相比无明显差异。母体孕期暴露于异氟烷或七氟烷的P0,P7,P14子代大鼠海马中GAP-43表达与对照组相比表达减弱(P＜0.01),PI组较PS组表达明显减弱(P＜0.01),P28组表达与对照组相比未见明显差异。母体孕前暴露于异氟烷或七氟烷的子代大鼠海马中nNOS的表达与对照组相比无明显差异。母体孕期暴露于异氟烷或七氟烷的P0,P7,P14子代大鼠海马中nNOS表达与对照组相比表达显著减弱(P＜0.01),PI组较PS组表达增强(P＜0.05),P28组表达与对照组相比未见明显差异。C组各时间点海马结构清晰,细胞排列规则,未见明显病理改变。同时可见对照组细胞核大,染色较浅,核仁清楚,染色质呈疏松状态。提示对照组细胞的功能比试验组更加旺盛。试验组中,PI组较对照组有较明显的病理变化,其余各组在HE染色切片中未见明显的组织病理学改变。可见PI组0天、7、14天皮质及海马细胞排列紊乱,细胞形状不规则。海马锥体细胞数量减少,细胞胞质浓缩,染色质聚集,细胞体积减小。PI28组与C组相比未见明显病理改变。电镜观察C,BI和BS组电镜观察细胞形态和超微结构未见明显变化,PI和PS组可见妊娠期吸入麻醉药各组0天、7天、14天细胞内线粒体嵴减少,缺损,空泡变性粗面内质网扩张,神经细胞核形不规则,凹陷,胞浆内可见凋亡小体,尤以生后七天变化最为明显,妊娠前吸入麻醉药各组细胞超微结构形态基本接近正常,核型较好,线粒体空泡变性,高尔基体丰富。28天各试验组海马超微结构形态基本接近正常。　　 实验二:NMDAR1和NMDAR2A免疫荧光结果提示:PI,PS,0天、7天、14天组中NMDAR1和NMDAR2A的含量均明显高于C组(P＜0.01),PI组表达较PS组显著增高(P＜0.01),而PI,PS28天组与C组相比未见明显差异。BI,BS各组与C组相比无明显差异。NMDAR2B免疫荧光结果提示,PI、PS0天、7天、14天组中NMDAR2B含量均显著低于C组(P＜0.01),PI组较PS组明显增高(P＜0.05),而PI,PS28组与C组相比未见明显差异,BI,BS各组与C组相比无明显差异。　　 RT-PCR结果显示,母体孕前暴露于异氟烷或七氟烷的子代大鼠海马中NMDAR1mRNA和NMDAR2AmRNA的表达与对照组相比无明显差异。母体孕期暴露于异氟烷或七氟烷的P0,P7,P14子代大鼠海马中NMDAR1mRNA和NMDAR2AmRNA表达与对照组相比表达增强(P＜0.05),PI组表达较PS组增强(P＜0.05),P28组表达与对照组相比未见明显差异。母体孕前暴露于异氟烷或七氟烷的子代大鼠海马中NMDAR2BmRNA的表达与对照组相比无明显差异。母体孕期暴露于异氟烷或七氟烷的P0,P7,P14子代大鼠海马中NMDAR2BmRNA表达与对照组相比表达减弱(P＜0.05),PI组表达较PS组减弱(P＜0.05),P28组表达与对照组相比未见明显差异。　　 实验三:Western-blotting检测结果显示,母体孕前暴露于异氟烷或七氟烷的子代大鼠海马中PKCα,p-JNK,p-ERK1/2和Fos表达与对照组相比无明显差异。母体孕期暴露于异氟烷或七氟烷的P0,P7,P14子代大鼠海马中PKCα,p-JNK表达与对照组相比表达显著增强(P＜0.01),PI组较PS组表达增多(P＜0.05)至P28天表达与对照组相比未见明显差异。母体孕期暴露于异氟烷或七氟烷的P0,P7,P14子代大鼠海马中p-ERK1/2和Fos蛋白表达与对照组相比表达显著减弱(P＜0.01),PI组较PS组表达减少(P＜0.05),P28组表达与对照组相比未见明显差异。　　 结论：　　 1.妊娠期特定时间吸入1MAC异氟烷或七氟烷6小时可引起子代大鼠脑发育的短时间异常,此种异常可于生后28天消失。　　 2.子代大鼠脑发育的短时间异常与NMDARmRNA在子代大鼠海马中表达异常相一致,提示子代大鼠脑发育的异常可能与异氟烷或七氟烷引起的NMDAR表达异常相关。　　 3.子代大鼠脑发育的短暂异常可能与异氟烷或七氟烷引起的MAPK信号传导通路异常有关。