论文部分内容阅读
研究背景多发性硬化症（Multiple sclerosis,MS）是一种中枢神经系统（Central nervous system,CNS）慢性炎性脱髓鞘性疾病,是导致青壮年（尤其是女性）严重身体残疾的常见原因。MS病因尚不明确,但既往研究表明MS可能是遗传易感性和众多环境因素相互作用的结果。MS发病年龄多在20至40岁,在确诊后25年,大约50%的患者需要永久使用轮椅。目前,虽然有多种药物可用于复发缓解型多发性硬化症（Relapsing-remitting multiple sclerosis,RRMS）的治疗,但尚无有效的促髓鞘修复和再生性临床药物。MS脱髓鞘病灶虽然存在大量少突胶质前体细胞（Oligodendrocyte precursor cells,OPC）聚集,但是可能受微环境等因素影响,这些细胞并不能有效分化和成熟为髓鞘化功能的少突胶质细胞,导致髓鞘再生受限,进而导致神经功能障碍无法得到根本的改善。MS导致的神经功能障碍、治疗的成本高昂、患者和其护理人员的工作保留率较低等因素给个人、家庭、社会造成了巨大的经济负担。因此,当前迫切需要建立针对MS治疗的新策略以促进MS患者髓鞘修复和轴索再生,然而,扭转这种不利局面的前提是我们对MS脱髓鞘和髓鞘再生障碍机制更为深入和全面的理解。本文利用重复性好、病灶位置相对稳定的铜腙（Cuprizone,CPZ）诱导的急性脱髓鞘模型,分析脱髓鞘和髓鞘再生机制,为MS神经损伤修复治疗奠定基础。研究目的本研究旨在阐明内质网应激参与少突胶质细胞凋亡和髓鞘脱失的分子机制,以期寻找导致脱髓鞘病变的关键性靶点,从而为以MS为代表的脱髓鞘疾病的临床干预提供新的治疗策略。研究方法首先,我们应用免疫荧光染色对不同时间节点的CPZ诱导的急性脱髓鞘模型小鼠胼胝体髓鞘脱失、少突胶质细胞组成、星形胶质细胞和小胶质细胞/巨噬细胞活化进行了评估。然后,将基线期（诱导前）、脱髓鞘高峰期（CPZ-5W）、髓鞘修复期（CPZ-5W-2W）三个时间节点的小鼠全脑细胞进行了单细胞转录组测序（Single-cellRNA sequencing,scRNA-seq）和生物信息学分析,并利用多重单分子荧光原位杂交（RNAscope in situ hybridization,RNAscope-ISH）对测序时间点的小鼠脑组织Sox10+少突胶质谱系细胞Atf4、Ddit3、Trib3 mRNA表达情况进行了检测,以初步验证测序结果。其次,利用蛋白激酶R样内质网激酶（Protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK）抑制剂GSK2656157（GSK,10 mg/kg/d）干预小鼠的同时诱导急性脱髓鞘,在CPZ摄入后,利用蛋白质免疫印迹对PERK介导的未折叠蛋白反应（Unfolded protein response,UPR）、AKT1信号、线粒体介导的内源性凋亡途径相关蛋白表达水平进行了比较,利用RNAscope-ISH对胼胝体少突胶质谱系细胞Atf4、Ddit3、Trib3 mRNA水平进行了比较,利用LFB染色、透射电镜分析、髓鞘碱性蛋白（Myelin basic protein,MBP）免疫荧光染色对胼胝体髓鞘完整性进行了评价,并利用免疫荧光染色对少突胶质细胞组成、星形胶质细胞和小胶质细胞/巨噬细胞活化进行了比较。此外,利用TRIB3基因敲除(Trib3-/-)小鼠和野生型（Wild-type,WT）小鼠诱导急性脱髓鞘,在CPZ摄入5周后,利用LFB染色对两组小鼠胼胝体髓鞘完整性进行比较,利用免疫荧光染色对胼胝体星形胶质细胞和小胶质细胞/巨噬细胞活化进行评价,利用RNAscope-ISH对胼胝体少突胶质细胞Ddit3和Trib3 mRNA表达水平进行评价,利用蛋白质免疫印迹对PERK介导的UPR、AKT1信号、线粒体介导的内源性凋亡途径相关蛋白表达水平进行了比较。再者,原位注射慢病毒使小鼠胼胝体少突胶质细胞过表达TRIB3,5 d后进行急性脱髓鞘诱导,在CPZ摄入后5周,利用免疫荧光染色对正常小鼠、对照病毒注射小鼠、TRIB3过表达病毒注射小鼠胼胝体TRIB3表达情况进行了比较,利用LFB染色对三组小鼠胼胝体髓鞘完整性进行了评价,利用蛋白质免疫印迹对PERK介导的UPR、AKT1信号、线粒体介导的内源性凋亡途径相关蛋白表达水平进行了比较。最后,为了评价PERK介导的UPR对神经炎症介导的脱髓鞘病变的影响,我们诱导了实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）,在髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（Myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG）肽段免疫后第3 d进行GSK（10 mg/kg/d）持续干预,每日进行临床行为评分,在免疫后15 d、21 d、35 d,利用免疫荧光染色评价两组小鼠脊髓腰骶膨大髓鞘完整性以及星形胶质细胞和小胶质细胞/巨噬细胞的活化情况。研究结果1.对CPZ诱导的小鼠急性脱髓鞘模型评估显示,胼胝体髓鞘脱失范围、总的少突胶质前体细胞（Oligodendrocyte precusor cell,OPC）数目、Ki67+OPC数目、星形胶质细胞和小胶质细胞/巨噬细胞的活化程度均呈现“先增加/强,后减小/弱”的趋势,但星形胶质细胞和小胶质细胞/巨噬细胞对CPZ诱导的脱髓鞘病变的动态响应并不同步。2.scRNA-seq结果显示脱髓鞘高峰期小鼠脑存在脱髓鞘响应性少突胶质细胞类群,该类群细胞PERK介导的UPR和线粒体介导的内源性凋亡相关基因上调,RNAscope-ISH结果也证实脱髓鞘高峰期小鼠胼胝体少突胶质谱系细胞UPR相关基因（Atf4、Ddit3、Trib3）高表达。3.GSK抑制PERK介导的UPR后,CPZ摄入小鼠胼胝体TRIB3、Puma、Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP1下调,p-AKT1和p-Fox O1上调,髓鞘脱失程度减轻。4.相比于野生型小鼠,CPZ摄入后TRIB3基因敲除小鼠胼胝体p-AKT1、p-Fox O1、Bcl-2上调,Puma、Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP1下调,髓鞘脱失范围减小。5.过表达TRIB3后,CPZ摄入小鼠胼胝体p-AKT1和Bcl-2下调,Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP1上调,髓鞘脱失范围增加。6.GSK阻断PERK介导的UPR后,EAE小鼠在疾病高峰期临床评分显著降低,髓鞘脱失范围、星形胶质细胞数目、小胶质细胞/巨噬细胞数目显著减少。研究结论本研究揭示了内质网应激参与髓鞘脱失的分子机制,即铜腙摄入触发了少突胶质细胞持续性内质网应激,并激活了PERK介导的终末UPR,持续激活的UPR通过上调下游TRIB3钝化AKT1促存活信号,进而启动了线粒体介导的内源性凋亡途径,最终造成少突胶质细胞凋亡和髓鞘脱失。TRIB3是联系内质网应激和线粒体介导的内源性凋亡的关键性致病分子,靶向TRIB3的干预策略对脱髓鞘疾病和内质网应激相关疾病有潜在的临床应用前景。