论文部分内容阅读
背景:原发性干燥综合征（primary Sj（?）gren’s syndrome,p SS）是由于免疫紊乱导致外分泌腺破坏和多系统病变的自身免疫性疾病,目前尚缺乏可以早期调节免疫紊乱阻止疾病进展,又可以修复晚期受损的组织,且安全有效的治疗方法。在p SS发病机制中CD4+T细胞的异常增殖、凋亡及分化起着非常关键的作用,与疾病的发生、发展及转归密切相关,因此如何抑制其异常增殖、凋亡及分化进而阻止疾病进展,成为探索p SS治疗的新方向。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）具有高度增殖、免疫调节及多向分化能力,已有研究发现MSCs可抑制p SS患者及动物模型中T细胞增殖及促炎因子分泌,减少唾液腺和泪腺淋巴细胞浸润,恢复外分泌腺功能。MSCs来源的外泌体（MSCs-derived exosomes,MSC-Exos）具有MSCs的免疫调节及组织修复作用,规避MSCs细胞治疗的局限性,有望成为治疗各种风湿性疾病的新策略,但MSC-Exos是否可以调节p SS发病的关键环节CD4+T细胞异常增殖、凋亡及分化,以及其中所涉及的具体机制尚有待阐明,这将为探索MSC-Exos作为p SS新的治疗方法及其在临床转化中的应用提供重要的理论依据和实验基础。目的:提取及鉴定人脐带MSCs（umbilical cord-derived MSCs,UCMSCs）来源的Exos（UCMSC-Exos）,研究UCMSC-Exos对p SS患者外周血CD4+T细胞的免疫调节作用及其中涉及的具体机制。方法:1.UCMSC-Exos的提取及鉴定:分离UCMSCs,检测细胞形态、表面抗原表型及成脂、成骨能力。差速超速离心法分离UCMSC-Exos,检测UCMSC-Exos形态、粒径大小、蛋白浓度及表面标记。2.UCMSC-Exos对p SS患者外周血CD4+T细胞发挥免疫调节作用:免疫磁珠分选外周血CD4+T细胞,设置健康对照（health control,HC）组、p SS组、UCMSC-Exos不同浓度组（30μg/m L、60μg/m L、90μg/m L）,CCK8法检测CD4+T细胞增殖,确定最佳干预浓度。之后设置HC组、p SS组、UCMSC-Exos组,流式细胞仪检测CD4+T细胞周期、凋亡、细胞亚群及炎性因子。3.UCMSC-Exos对p SS患者外周血CD4+T细胞自噬水平的调控作用:生物信息学技术分析HC和p SS患者外周血CD4+T细胞差异基因富集于自噬通路;设置HC组、p SS组、UCMSC-Exos组,透射电镜检测CD4+T细胞自噬体,Western blot方法检测自噬蛋白,RT-PCR方法检测自噬基因。4.UCMSC-Exos通过自噬途径对p SS患者外周血CD4+T细胞发挥免疫调节作用:设置p SS组、UCMSC-Exos组、自噬诱导剂雷帕霉素（rapamycin,RAPA）组、RAPA+UCMSC-Exos组、自噬抑制剂羟氯喹（hydroxychloroquine,HCQ）组、HCQ+UCMSC-Exos组,流式细胞仪检测CD4+T细胞周期、凋亡及细胞亚群。结果:1.UCMSC-Exos的提取及鉴定:UCMSCs呈贴壁生长、成纤维样形状;流式细胞仪检测UCMSCs高表达CD73、CD90、CD105,低表达CD45、CD34、HLA-DR;具有成骨及成脂能力。UCMSC-Exos为囊泡样结构,茶托状,周围为脂质双分子结构,平均直径约130nm;NTA技术分析直径为144.4±44.0nm,平均137.7nm,粒子浓度为2.0×1011particles/m L;BCA法检测蛋白浓度为1.00μg/μL;Western blot法检测表面标记为CD9、CD63、TSG101阳性,calnexin阴性,而UCMSCs为CD9、calnexin阳性,CD63、TSG101阴性。2.UCMSC-Exos对p SS患者外周血CD4+T细胞发挥免疫调节作用:⑴免疫磁珠分选CD4+T细胞纯度达98.29%。⑵p SS组外周血CD4+T细胞增殖较HC组增强;UCMSC-Exos（60μg/m L、90μg/m L）组增殖较p SS组降低,以90μg/m L作用最强,以此为后续实验干预浓度。⑶流式细胞仪检测p SS组外周血CD4+T细胞增殖较HC组增加,并且处于G0/G1期的细胞比例减少,处于S期的比例增加;UCMSC-Exos组CD4+T细胞增殖较p SS组降低,并且处于G0/G1期的细胞比例增多,处于S期的比例减少;三组之间处于G2/M期的细胞比例无显著差异。⑷p SS组外周血CD4+T细胞早期、晚期及总体凋亡比例较HC组增加;UCMSC-Exos组早期、晚期及总体凋亡比例较p SS组降低,较HC组无显著差异。⑸三组Th1细胞比例无显著差异。与HC组比较,p SS组Th2、Treg细胞比例降低,Th17细胞比例、Th1/Th2、Th17/Treg升高;与p SS组比较,UCMSC-Exos组Th17细胞比例、Th1/Th2、Th17/Treg降低,Treg细胞比例升高,Th2细胞比例呈升高趋势,但无统计学差异。⑹与HC组比较,p SS组IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6、IL-17A、IL-17F表达升高,TGF-β表达降低,IL-10呈下降趋势,但无统计学差异;与p SS组比较,UCMSC-Exos组IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-17A、IL-17F表达降低,IL-10、TGF-β表达升高,IL-2呈下降趋势,但无显著差异;三组IL-4、IL-22无显著差异。3.UCMSC-Exos对p SS患者外周血CD4+T细胞自噬水平的调控作用:⑴采用生物信息学技术分析HC及p SS患者外周血CD4+T细胞转录组数据,共获得244个差异表达的基因,KEGG富集分析发现差异基因富集于自噬通路。⑵p SS组CD4+T细胞中观察到自噬溶酶体,而HC及UCMSC-Exos组无此现象。与HC组比较,p SS组Beclin1、Atg5、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及Beclin1 m RNA、Atg5 m RNA、LC3Ⅱm RNA表达升高;与p SS组比较,UCMSC-Exos组这些指标均降低,且与HC组比较无显著差异。4.UCMSC-Exos通过自噬途径对p SS患者外周血CD4+T细胞发挥免疫调节作用:⑴与p SS组比较,UCMSC-Exos、RAPA、RAPA+UCMSC-Exos组CD4+T细胞增殖指数降低;与RAPA组比较,RAPA+UCMSC-Exos组CD4+T细胞增殖指数进一步降低。与p SS组比较,UCMSC-Exos、HCQ、HCQ+UCMSC-Exos组CD4+T细胞增殖指数降低;与HCQ组比较,HCQ+UCMSC-Exos组CD4+T细胞增殖指数进一步降低。⑵与p SS组比较,UCMSC-Exos组CD4+T细胞早期凋亡比例降低,RAPA组CD4+T细胞早期凋亡比例升高;与RAPA组比较,RAPA+UCMSC-Exos组CD4+T细胞早期凋亡比例下降。与p SS组比较,UCMSC-Exos、HCQ、HCQ+UCMSC-Exos组CD4+T细胞早期凋亡比例降低;与HCQ组比较,HCQ+UCMSC-Exos组CD4+T细胞早期凋亡比例进一步降低。⑶各组Th1、Th2细胞比例无显著差异。与p SS组比较,UCMSC-Exos组Th17细胞比例、Th17/Treg降低,Treg细胞比例升高;RAPA组Treg细胞比例降低,Th17细胞比例呈下降趋势,Th17/Treg呈升高趋势,但无统计学差异;与RAPA组比较,RAPA+UCMSC-Exos组Th17细胞比例、Th17/Treg降低,Treg细胞比例升高。与p SS组比较,UCMSC-Exos、HCQ、HCQ+UCMSC-Exos组Th17细胞比例、Th17/Treg降低,Treg细胞比例升高。与HCQ组比较,HCQ+UCMSC-Exos组Th17细胞比例、Th17/Treg进一步降低,Treg细胞比例进一步升高。结论:1.UCMSCs符合国际细胞治疗学会定义的MSCs标准;UCMSC-Exos符合MSCs来源的Exos特点。2.UCMSC-Exos抑制p SS患者外周血CD4+T细胞过度增殖及过度凋亡,并将CD4+T细胞阻滞于G0/G1期,抑制其进入S期;下调Th17细胞比例,上调Treg细胞比例,恢复Th1/Th2及Th17/Treg平衡;抑制CD4+T细胞相关促炎因子IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-17A、IL-17F分泌,促进抗炎因子IL-10、TGF-β分泌,对CD4+T细胞发挥免疫调节作用。3.p SS患者外周血CD4+T细胞自噬水平升高,UCMSC-Exos可降低其自噬水平。4.UCMSC-Exos通过自噬途径调节p SS患者外周血CD4+T细胞增殖及早期凋亡,抑制Th17细胞分化,促进Treg细胞分化,恢复Th17/Treg平衡。