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干扰素(interferons,IFNs)属于细胞因子家族,具有诸如抗病毒、抗肿瘤以及免疫调节作用等广泛的生物学活性。目前,商品化的干扰素制品已逐渐在动物生产和兽医临床中应用。
本研究从狮头鹅外周血细胞中提取基因组DNA,采用巢式PCR方法扩增狮头鹅α-干扰素基因片段(GoIFN-α);及从ConA刺激的培养外周血淋巴细胞提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增狮头鹅γ-干扰素基因cDNA片段(GoIFN-γ),将扩增片段分别克隆到pGEM-T载体(pGEM-T-GoIFN-α/γ)并进行序列测定。结果表明,GoIFN-α基因全长576bp,编码191个氨基酸和一个终止密码子,分析其与其它品种家禽IFN-α的核苷酸序列同源性介于41.2%~98.3%之间,推导的氨基酸序列同源性为13.0%~96.4%;GoIFN-γ基因的cDNA编码区全长495bp,编码164个氨基酸和一个终止密码子,分析其与其它品种家禽的IFN-γ核苷酸序列同源性介于82.4%~99.6%之间,推导的氨基酸序列同源性为66.7%~98.8%;结果表明不同品种鹅间的干扰素具有极为相似的蛋白质二级结构;同时亲缘关系越近的物种同源性就越高,不同物种在进化过程中的变化较大。
采用PCR方法从重组质粒pGEM-T-GoIFN-α中扩增到GoIFN-α基因成熟肽基因编码序列,将成熟肽编码序列亚克隆至表达载体pET32a(+),成功构建原核融合表达质粒pET32a-rGoIFN-α。重组质粒pET32a-rGoIFN-α转化表达菌种BL21,采用IPTG诱导,收获菌体裂解后,经SDS-PAGE电泳检测在36KDa有一条特异的重组狮头鹅α-干扰素融合蛋白(rGoIFN-α)条带,大小与预期结果相同。试验优化rGoIFN-α表达条件,结果表明rGoIFN-α在30℃IPTG诱导表达4h的目的蛋白表达量最高。经过不同IPTG浓度、不同温度诱导表达的rGoIFN-α的可溶性分析后,结果表明rGoIFN-α主要以包涵体的形式存在。采用溶菌酶和超声波裂解、4mol/L尿素洗涤、8mol/L尿素溶解、超滤纯化和复性,得到纯度较高的rGoIFN-α。融合蛋白经过肠激酶酶切、镍离子柱亲和纯化、透析浓缩得到狮头鹅α-干扰素蛋白。纯化后的蛋白用于狮头鹅α-干扰素抗病毒活性的研究。rGoIFN-α经过Westernblot分析,在硝酸纤维素膜上检测到分子大小约为36KDa的特异性蛋白条带,表明rGoIFN-α能与抗体进行特异性反应。
采用微量中和试验评价了rGoIFN-α的抗病毒活性。制备鸡胚成纤维细胞,采用TCID50法测定NDVRoakin病毒株的鸡胚成纤维细胞半数感染量。试验结果表明,NDVRoakin病毒株的TCID50是10-4.5465。成纤维细胞病变抑制试验检测rGoIFN-α抗病毒活性。结果表明,在50TCID50攻毒时rGoIFN-α处理的鸡胚成纤维细胞,rGoIFN-α能够抑制NDVRoakin病毒在鸡胚成纤维细胞中复制,复性后纯化的rGoIFN-α(rGoIFN-α)的抗病毒活性达1.42×104U/mg;酶切后rGoIFN-α(eGoIFN-α)的抗病毒活性达8.23×104U/mg:切除融合肽后并用亲和层析纯化的rGolFN-α(GoIFN-α)抗病毒活性达3.34×105U/mg。