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研究背景和目的： 我国是肝癌的“重灾国”。晚期肝癌的治疗一直以来是临床中亟需予以克服的难题。分子靶向药物索拉非尼（Sorafenib）是晚期肝癌的标准治疗，但只有中等程度的获益。近年来，以吉西他滨（Gemcitabine，GEM）和奥沙利铂（Oxaliplatin， OXA）为代表的新型细胞毒药物在晚期肝癌的治疗上显示出良好的前景。然而，获得性耐药仍然是制约此类药物在晚期肝癌中发挥最大效能的主要因素。 为了探索肝癌的耐药机制以及寻求克服耐药的治疗策略，在既往研究中我们建立了GEM耐药肝癌模型，发现GEM耐药肝癌细胞发生了上皮间质样转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT），进一步研究表明EMT的发生可能是肝癌细胞对GEM产生耐药的主要机制。本研究在前期研究基础上，探讨Nutlin-3对GEM耐药肝癌细胞发生EMT的逆转作用及其分子机制，为以逆转EMT信号通路为靶点克服耐药应用于临床提供新的理论基础。 方法： 1.在既往已经建立的肝细胞癌HepG2和SMMC-7721的GEM耐药细胞模型（以下简称“HepG2 GR”和“SMMC-7721 GR”细胞）基础上，采用MTT法检测Nutlin-3对HepG2 GR和SMMC-7721 GR细胞的敏感性并绘制增殖曲线。 2.观察Nutlin-3干预HepG2 GR和SMMC-7721 GR细胞后发生的形态学改变，并通过细胞划痕、迁移侵袭、粘附和分离实验考察干预前后生物学活性的变化。 3.利用实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）和蛋白质印迹法（Western-Blot）检测Nutlin-3干预HepG2 GR和SMMC-7721 GR细胞前后EMT分子表型E-钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、Snail和Slug的表达情况。 4.在肝癌亲本（HepG2和SMMC-7721）和GEM耐药肝癌细胞（HepG2 GR和SMMC-7721 GR）中，以qRT-PCR、Western-Blot法检测GEM耐药肝癌细胞发生EMT过程中Smad2的mRNA水平和蛋白表达；Nutlin-3干预GEM耐药肝癌细胞，以qRT-PCR、Western-Blot法检测Smad2 mRNA水平和蛋白表达情况。 5.在HepG2 GR中，通过Smad2 siRNAs瞬时沉默Smad2基因表达，验证干扰效率后，以qRT-PCR、Western-Blot法测定E-cadherin、Vimentin、Snail和Slug的表达，考察Smad2瞬时沉默对GEM耐药肝癌细胞EMT分子表型的影响。 6.在HepG2 GR中，转染Smad2 siRNA1后，通过形态学观察、迁徙侵袭、划痕实验、细胞粘附和分离实验，考察Smad2瞬时沉默对耐药肝癌细胞EMT生物学特征的影响。 结果： 1.Nutlin-3对GEM耐药肝癌细胞（HepG2 GR和SMMC-7721 GR）的增殖产生抑制作用。 2.Nutlin-3干预GEM耐药肝癌细胞（HepG2GR和SMMC-7721 GR）后，发生了形态学改变，细胞极性逐渐恢复、伪足减少，细胞呈卵圆形，且聚集生长。 3.Nutlin-3干预GEM耐药肝癌细胞（HepG2 GR和SMMC-7721GR）后，耐药细胞运动能力减弱，侵袭能力下降。 4.Nutlin-3可逆转GEM耐药肝癌细胞（HepG2 GR和SMMC-7721 GR）EMT分子表型，EMT分子表型E-cadherin表达上调，Vimentin、Snail、Slug表达下调。 5.Smad2在GEM耐药肝癌细胞（HepG2GR和SMMC-7721 GR）中较亲本细胞显著高表达，Nutlin-3可下调GEM耐药肝癌细胞中Smad2表达。 6.瞬时沉默GEM耐药肝癌细胞（HepG2 GR）中Smad2表达，可逆转HepG2 GR细胞EMT分子表型，改变HepG2 GR细胞生物学特性。 结论： 1.Nutlin-3可逆转GEM耐药肝癌细胞（HepG2 GR和SMMC-7721 GR）上皮间质样转化，并降低了耐药肝癌细胞运动、侵袭能力。 2. Nutlin-3逆转GEM耐药肝癌细胞EMT的机制可能是抑制了Smad2蛋白转录活性，影响与EMT有关的转录因子Snail和Slug的表达，从而发挥抗EMT作用。