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锌指蛋白Zbtb20是一种含有POZ/BTB和C2H2锌指结构的转录因子，可能在多种器官和组织的发育和功能调节中具有非常广泛和重要的作用。Zbtb20在出生后的肝脏中开始上调表达，到出生后8周达到成年水平。为了深入研究Zbtb20的体内生物学作用，我们利用Cre/LoxP条件基因打靶技术，成功建立了Zbtb20的肝细胞特异性基因敲除小鼠模型。通过对该小鼠模型的体内以及体外实验研究表明，Zbtb20是调控肝脏甲胎蛋白基因转录的重要转录抑制因子。然而目前还不清楚Zbtb20对肝细胞的体内物质代谢和解毒功能有何影响。
为了揭示Zbtb20因缺失后的肝细胞的物质代谢和解毒能力，我们建立了四氯化碳(CCl4)所致的急性肝损伤和慢性肝纤维化模型，系统比较了该基因敲除小鼠与正常对照小鼠的急性肝损伤程度、损伤后组织修复能力和慢性肝纤维化程度，并在此基础上对肝脏参与CCl4代谢的关键酶一细胞色素P4502E1(Cyp2E1)的蛋白、mRNA、hnRNA表达水平进行分析，最后对影响Cyp2E1基因表达的因素进行初步分析，取得以下结果：
一、Zbtb20肝细胞特异性基因敲除小鼠对CCl4急性肝损伤具有抵抗作用。
具体表现在以下三方面：(1)组织学分析表明：单次注射CCl4后，Zbtb20基因敲除小鼠和正常对照小鼠肝损伤高峰期均出现在注射后24 h，然而无论是在损伤高峰期还是此后的48 h和72 h，Zbtb20基因敲除肝组织的坏死面积均明显低于正常对照组，而且能很快得到修复。(2)TUNEL分析表明CCl4注射后72 h，Zbtb20基因敲除肝组织中的凋亡细胞数显著低于正常对照组。(3)CCl4注射后24 h、48 h和72 h，Zbtb20肝细胞特异性基因敲除小鼠的血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平均显著低于正常对照小鼠。而注射橄榄油(溶剂组)后，Zbtb20肝细胞特异性基因敲除小鼠的肝组织结构、凋亡细胞数及血清ALT和AST水平与正常对照小鼠相比均无显著差异。以上结果表明Zbtb20肝细胞特异性基因敲除小鼠对CCl4的急性肝毒作用具有低敏感性。
二、CCl4急性肝损伤后Zbtb20缺失肝细胞未出现增殖活性异常增高现象。
为了检测肝细胞的增殖能力，我们在给小鼠注射CCl4后不同时间点进行了BrdU掺入实验，结果显示：CCl4注射后24 h，Zbtb20基因敲除和正常对照肝组织中出现少量散在分布的BrdU阳性细胞，在数量上两者没有显著性差异，提示在损伤的同时修复机制已开始启动。CCl4注射后48 h，Zbtb20敲除和正常对照肝组织中肝细胞增殖出现高峰，并且前者的增殖细胞比后者少，可能与其损伤程度轻有关。为了进一步证实BrdU的分析结果，我们又对肝组织进行了细胞增殖标记蛋白Ki67和PCNA的免疫组化标记，结果与BrdU标记结果一致。溶剂组的Zbtb20基因敲除肝组织仅有很少BrdU阳性细胞，与正常对照小鼠相比无显著性差异，表明大部分肝细胞处于静息期。以上检测结果排除了Zbtb20基因敲除肝细胞在注射CCl4后发生异常高增殖的可能性，提示该小鼠对CCl4的低敏感性可能是由于其他机制造成的。
三、Zbtb20肝细胞特异性基因敲除小鼠对CCl4慢性肝纤维化作用具有低敏感性。
小鼠连续6周注射CCl4(每周2次)后，取肝组织进行HE和胶原纤维染色分析。染色结果显示正常对照肝组织在肝中央静脉周围区可见到肝细胞坏死、大量炎性细胞浸润和结缔组织增生，部分肝小叶结构紊乱，Sirius Red染色显示广泛的桥接纤维间隔形成“蜂巢”样结构。与对照小鼠相比，Zbtb20基因敲除肝组织炎症反应较轻，肝小叶结构基本完整，桥接纤维间隔较少，相对胶原纤维面积较小。说明Zbtb20基因敲除肝脏对CCl4慢性肝纤维化作用同样具有抵抗性。
四、Zbtb20基因敲除肝组织中Cyp2E1 mRNA和蛋白表达水平下调，而Cyp2E1 hnRNA水平没有改变。
CCl4的急慢性损伤实验结果表明Zbtb20基因敲除肝组织对CCl4的敏感性远远低于正常对照组，为了进一步揭示其分子机理，我们对影响CCl4体内活化的关键酶Cyp2E1的蛋白表达水平进行检测。Western Blot结果显示，Zbtb20基因敲除肝组织中Cyp2E1蛋白的相对表达量与正常对照相比下调了60％。接着我们又对Cyp2E1蛋白的表达进行免疫组化分析。结果显示在Zbtb20基因敲除肝组织中该蛋白的表达仍遵循肝小叶中心区强而门管区弱的区域性特征，但阳性标记区域比对照组明显缩小。荧光定量PCR检测结果表明Zbtb20基因敲除肝组织中Cyp2E1mRNA水平下调了50％，而其hnRNA的水平与对照组相比没有显著性差异。提示该基因的表达在转录后水平受抑。
五、Zbtb20基因敲除肝组织中HNF1αmRNA表达水平和β-catenin的活化水平没有改变。
为了进一步揭示Zbtb20基因敲除肝组织中Cyp2E1 mRNA水平下调的分子机制，我们检测了目前已知的在该基因转录激活中起主要作用的转录因子HNF1α的mRNA水平，结果显示，其mRNA表达水平与正常对照没有显著差异。β-catenin被报道可以影响Cyp2E1mRNA的转录，因此我们又检测了该蛋白的活化形式(activeβ-catenin)在Zbtb20因敲除肝组织中的表达水平，发现与正常对照也没有显著差异。鉴于Zbtb20基因敲除肝组织中Cyp2E1 hnRNA表达水平没有改变，影响该分子转录的HNF1αmRNA和activeβ-catenin水平均与对照小组没有显著差异，因此我们推测造成Cyp2E1mRNA下调的机制可能发生在转录后水平。
六、Zbtb20肝细胞特异性基因敲除小鼠血清胰岛素水平没有改变，甲状腺素反应基因Spot14mRNA表达水平没有明显变化。
为了揭示Zbtb20基因敲除肝组织中Cyp2E1 mRNA下调的转录后机制，我们检测了与其mRNA稳定性相关的血浆胰岛素和T3水平，并进一步检测了肝组织中的甲状腺素反应基因Spot14(S14)的表达水平。检测结果显示，Zbtb20肝细胞特异性基因敲除小鼠血浆胰岛素水平与正常对照小鼠没有统计学差异；血浆甲状腺素T3水平比对照组略高但肝组织中的甲状腺素反应基因Spot14的表达水平与对照小鼠没有统计学差异。
总结以上实验结果，我们得出以下结论：Zbtb20肝细胞特异性基因敲除后引起Cyp2E1 mRNA和蛋白水平下调，从而导致该小鼠对CCl4诱导的急性肝毒作用和慢性肝纤维化作用产生抵抗性。导致该小鼠肝细胞中Cyp2E1 mRNA水平下调的机制可能发生在转录后水平。以上结果表明Zbtb20除了调控甲胎蛋白基因转录外，还可能参与调控肝细胞的物质代谢和解毒功能。
为了揭示Zbtb20因缺失后的肝细胞的物质代谢和解毒能力，我们建立了四氯化碳(CCl4)所致的急性肝损伤和慢性肝纤维化模型，系统比较了该基因敲除小鼠与正常对照小鼠的急性肝损伤程度、损伤后组织修复能力和慢性肝纤维化程度，并在此基础上对肝脏参与CCl4代谢的关键酶一细胞色素P4502E1(Cyp2E1)的蛋白、mRNA、hnRNA表达水平进行分析，最后对影响Cyp2E1基因表达的因素进行初步分析，取得以下结果：
一、Zbtb20肝细胞特异性基因敲除小鼠对CCl4急性肝损伤具有抵抗作用。
具体表现在以下三方面：(1)组织学分析表明：单次注射CCl4后，Zbtb20基因敲除小鼠和正常对照小鼠肝损伤高峰期均出现在注射后24 h，然而无论是在损伤高峰期还是此后的48 h和72 h，Zbtb20基因敲除肝组织的坏死面积均明显低于正常对照组，而且能很快得到修复。(2)TUNEL分析表明CCl4注射后72 h，Zbtb20基因敲除肝组织中的凋亡细胞数显著低于正常对照组。(3)CCl4注射后24 h、48 h和72 h，Zbtb20肝细胞特异性基因敲除小鼠的血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平均显著低于正常对照小鼠。而注射橄榄油(溶剂组)后，Zbtb20肝细胞特异性基因敲除小鼠的肝组织结构、凋亡细胞数及血清ALT和AST水平与正常对照小鼠相比均无显著差异。以上结果表明Zbtb20肝细胞特异性基因敲除小鼠对CCl4的急性肝毒作用具有低敏感性。
二、CCl4急性肝损伤后Zbtb20缺失肝细胞未出现增殖活性异常增高现象。
为了检测肝细胞的增殖能力，我们在给小鼠注射CCl4后不同时间点进行了BrdU掺入实验，结果显示：CCl4注射后24 h，Zbtb20基因敲除和正常对照肝组织中出现少量散在分布的BrdU阳性细胞，在数量上两者没有显著性差异，提示在损伤的同时修复机制已开始启动。CCl4注射后48 h，Zbtb20敲除和正常对照肝组织中肝细胞增殖出现高峰，并且前者的增殖细胞比后者少，可能与其损伤程度轻有关。为了进一步证实BrdU的分析结果，我们又对肝组织进行了细胞增殖标记蛋白Ki67和PCNA的免疫组化标记，结果与BrdU标记结果一致。溶剂组的Zbtb20基因敲除肝组织仅有很少BrdU阳性细胞，与正常对照小鼠相比无显著性差异，表明大部分肝细胞处于静息期。以上检测结果排除了Zbtb20基因敲除肝细胞在注射CCl4后发生异常高增殖的可能性，提示该小鼠对CCl4的低敏感性可能是由于其他机制造成的。
三、Zbtb20肝细胞特异性基因敲除小鼠对CCl4慢性肝纤维化作用具有低敏感性。
小鼠连续6周注射CCl4(每周2次)后，取肝组织进行HE和胶原纤维染色分析。染色结果显示正常对照肝组织在肝中央静脉周围区可见到肝细胞坏死、大量炎性细胞浸润和结缔组织增生，部分肝小叶结构紊乱，Sirius Red染色显示广泛的桥接纤维间隔形成“蜂巢”样结构。与对照小鼠相比，Zbtb20基因敲除肝组织炎症反应较轻，肝小叶结构基本完整，桥接纤维间隔较少，相对胶原纤维面积较小。说明Zbtb20基因敲除肝脏对CCl4慢性肝纤维化作用同样具有抵抗性。
四、Zbtb20基因敲除肝组织中Cyp2E1 mRNA和蛋白表达水平下调，而Cyp2E1 hnRNA水平没有改变。
CCl4的急慢性损伤实验结果表明Zbtb20基因敲除肝组织对CCl4的敏感性远远低于正常对照组，为了进一步揭示其分子机理，我们对影响CCl4体内活化的关键酶Cyp2E1的蛋白表达水平进行检测。Western Blot结果显示，Zbtb20基因敲除肝组织中Cyp2E1蛋白的相对表达量与正常对照相比下调了60％。接着我们又对Cyp2E1蛋白的表达进行免疫组化分析。结果显示在Zbtb20基因敲除肝组织中该蛋白的表达仍遵循肝小叶中心区强而门管区弱的区域性特征，但阳性标记区域比对照组明显缩小。荧光定量PCR检测结果表明Zbtb20基因敲除肝组织中Cyp2E1mRNA水平下调了50％，而其hnRNA的水平与对照组相比没有显著性差异。提示该基因的表达在转录后水平受抑。
五、Zbtb20基因敲除肝组织中HNF1αmRNA表达水平和β-catenin的活化水平没有改变。
为了进一步揭示Zbtb20基因敲除肝组织中Cyp2E1 mRNA水平下调的分子机制，我们检测了目前已知的在该基因转录激活中起主要作用的转录因子HNF1α的mRNA水平，结果显示，其mRNA表达水平与正常对照没有显著差异。β-catenin被报道可以影响Cyp2E1mRNA的转录，因此我们又检测了该蛋白的活化形式(activeβ-catenin)在Zbtb20因敲除肝组织中的表达水平，发现与正常对照也没有显著差异。鉴于Zbtb20基因敲除肝组织中Cyp2E1 hnRNA表达水平没有改变，影响该分子转录的HNF1αmRNA和activeβ-catenin水平均与对照小组没有显著差异，因此我们推测造成Cyp2E1mRNA下调的机制可能发生在转录后水平。
六、Zbtb20肝细胞特异性基因敲除小鼠血清胰岛素水平没有改变，甲状腺素反应基因Spot14mRNA表达水平没有明显变化。
为了揭示Zbtb20基因敲除肝组织中Cyp2E1 mRNA下调的转录后机制，我们检测了与其mRNA稳定性相关的血浆胰岛素和T3水平，并进一步检测了肝组织中的甲状腺素反应基因Spot14(S14)的表达水平。检测结果显示，Zbtb20肝细胞特异性基因敲除小鼠血浆胰岛素水平与正常对照小鼠没有统计学差异；血浆甲状腺素T3水平比对照组略高但肝组织中的甲状腺素反应基因Spot14的表达水平与对照小鼠没有统计学差异。
总结以上实验结果，我们得出以下结论：Zbtb20肝细胞特异性基因敲除后引起Cyp2E1 mRNA和蛋白水平下调，从而导致该小鼠对CCl4诱导的急性肝毒作用和慢性肝纤维化作用产生抵抗性。导致该小鼠肝细胞中Cyp2E1 mRNA水平下调的机制可能发生在转录后水平。以上结果表明Zbtb20除了调控甲胎蛋白基因转录外，还可能参与调控肝细胞的物质代谢和解毒功能。