论文部分内容阅读
为了阐明禽多杀性巴氏杆菌荚膜和OmpH的关系及其致病性,本研究分别构建pWSK29hexABC和pWSK29ompH两个敲除载体,电转化法将敲除载体导入禽巴氏杆菌强毒株C48-3中,筛选获得C48-3hexABC和C48-3ompH缺失突变株,利用大肠杆菌-巴氏杆菌穿梭质粒pPBA1101构建互补株C48-3C。DNA测序结果显示,突变株C48-3hexABC基因组中敲除了253bp的hexC基因下游序列、798bp的hexB基因全序列和290bp的hexA基因上游序列,突变株C48-3ompH用四环素替换1062bpompH基因。使用交叉PCR以及RT-PCR结果显示hexB基因和ompH基因缺失,不能正常转录;突变株C48-3hexABC、C48-3ompH与野生株C48-3形态一致,但突变株C48-3hexABC和C48-3ompH的生长速率慢;透视电镜观察突变株C48-3hexABC细菌表面无荚膜层,突变株C48-3ompH细菌表面的荚膜层不完整且较薄;C48-3ompH不能表达39kDa的OmpH;Westernblot显示抗天然OmpH抗体不能与C48-3ompH菌体蛋白特异性结合。突变株C48-3hexABC可正常转录ompH基因和突变株C48-3ompH正常转录hexB基因;突变株C48-3?hexABC和C48-3?ompH的fis基因的序列与野生株C48-3株和X-73株fis基因序列(AF067175)一致,未发生突变。结果表明,荚膜合成的缺失不影响OmpH的表达,而OmpH缺失影响荚膜的合成。 为了研究OmpH和荚膜在禽巴氏杆菌中的致病性。本研究采用小鼠毒力试验、粘附试验、粘附抑制试验、抗吞噬试验以及吞噬抑制试验。结果显示野突变株C48-3hexABC毒力明显减弱,突变株C48-3ompH组毒力相对减弱。突变株C48-3ompH对CEF细胞的附着能力显著降低(P<0.01)。抗rOmpH抗体显著抑制了野生株C48-3、突变株C48-3hexABC和互补株C48-3C对CEF细胞的粘附(P<0.01),而抗rOmpH抗体对突变株C48-3?ompH粘附的抑制作用不明显(P>0.05)。巨噬细胞对突变株C48-3?hexABC和突变株C48-3ompH的吞噬指数显著高于野生株C48-3株和互补株C48-3C(P<0.01),抗OmpH抗体处理促进巨噬细胞对突变株C48-3?hexABC的吞噬能力。研究结果表明荚膜是巴氏杆菌毒力因子,OmpH是具有粘附、抗吞噬能力的外膜蛋白。 本研究的结果为深入探讨荚膜与外膜蛋白OmpH在禽巴氏杆菌中的致病性和致病机理以及预防和治疗巴氏杆菌病奠定基础,为进一步研究高效、安全、无毒的疫苗提供候选菌株。