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α-乙酰乳酸脱羧酶(α-acetolactate decarboxylase，α-ALDC，EC.4.1.1.5)能催化双乙酰(diacetyl)的前体物α-乙酰乳酸快速脱羧形成乙偶姻，避免双乙酰的生成，在啤酒等食品发酵行业具有广泛应用。本研究从自然界分离筛选出两株α-ALDC生产菌，克隆α-ALDC基因并构建重组大肠杆菌和重组枯草芽孢杆菌进行过量表达，研究了枯草芽孢杆菌表达体系所得纯酶的酶学性质，优化放大了重组枯草芽孢杆菌的发酵产酶条件，最终达到高效产酶且更适合工业应用的目的。从自然界分离得到80株V.P试验阳性菌，经平板初步筛选和摇瓶发酵，得到15株产α-ALDC菌株。进一步复筛，得到两株高产α-ALDC菌株，经生理生化鉴定及16S rRNA序列分析，确定为Staphyloccocus aureus L3-15和Bacillus subtilis L5-20。构建重组大肠杆菌，表达了两个不同来源的α-ALDC基因。结果显示，来源于S.aureus L3-15的基因Saald大小为705bp，构建的重组大肠杆菌E. coliBL21/pET-28a(+)-Saald表达的α-ALDC总酶活为22.3U/mL，比出发菌提高了52倍；来源于B. subtilis L5-20的基因BsalsD大小为768bp，构建的重组大肠杆菌E. coliBL21/pET-28a(+)-BsalsD表达的α-ALDC总酶活为18.5U/mL，比出发菌提高了53倍。在两个不同来源的α-ALDC基因下游序列插入6个His编码基因，并与载体pMA5相连，构建重组载体pMA5-Saald和pMA5-BsalsD，分别转化至B. subtilis WB600中构建重组枯草芽孢杆菌。结果表明，Saald和BsalsD基因都可以在B. subtilis WB600中得到成功表达，Saald基因表达的重组蛋白SaALDC总酶活36.0U/mL，而BsalsD基因表达的BsALDC总酶活为27.0U/mL，分别比其相应的出发菌提高了也约80倍。重组枯草芽孢杆菌发酵所得粗酶液经Ni-NTA纯化，得到的SaALDC纯酶液，比酶活为469.5U/mg，最适pH为6.0，最适反应温度为35℃，Km为17.7μmol/L，Vmax为2.06mmol/(L·min)；得到的BsALDC纯酶液，比酶活为272.3U/mg，最适pH为6.0，最适反应温度为25℃，Km为29.04μmol/L，Vmax为2.82mmol/(L·min)。相比SaALDC而言，BsALDC表现出较好的温度适应性，更具工业应用前景。优化了重组枯草芽孢杆菌B. subtilis WB600/pMA5-BsalsD的发酵产酶培养基及培养条件。获得的最佳培养基配方为：甘油52g/L、大豆蛋白胨12g/L、磷酸盐25mmol/L、MgSO4·7H2O4.0mmol/L、尿素3g/L，NiSO4·6H2O1.5mmol/L，玉米浆15g/L，NaCl5g/L。最佳培养条件为：培养温度37℃，培养基初始pH6.5~7.0，接种量6%，摇床转速200r/min。利用5L发酵罐发酵培养重组枯草芽孢杆菌，α-ALDC酶活在48h达到105.8U/mL，其中胞内、胞外α-ALDC酶活分别为54.3U/mL和51.5U/mL。