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目的:糖尿病视网膜病变是糖尿病的严重并发症之一,是成年人获得性致盲的主要原因。糖尿病视网膜病变的特征包括视神经受损、毛细血管基底膜增厚、视网膜周细胞和内皮细胞的丢失、微动脉瘤的形成、视网膜新生血管生成和玻璃体出血。DR视力损害的原因是复杂的,目前尚未完全阐明。大量证据表明,慢性低度炎症的持续存在是DR重要的发病机制之一。 HMGB1又称为高迁移率蛋白1,做为一种公认的促炎症因子,HMGB1在糖尿病视网膜病变中的作用已经引起了研究人员的关注。然而,HMGB1 siRNA能否在高糖环境下保护视网膜细胞的形态变化和功能异常尚鲜有研究。本研究旨在探讨HMGB1 siRNA在糖尿病视网膜病变中的保护作用。 研究方法:第一部分:通过链脲佐菌素腹腔注射建立糖尿病视网膜病变的大鼠模型和用高浓度葡萄糖处理视网膜血管内皮细胞建立体外细胞模型,检测HMGB1在体内外高糖环境下视网膜细胞中的表达。第二部分实验分体内和体外两部分。体内部分:80只SD大鼠随机分为4组:正常对照组(NC组)、糖尿病组(DM组)、非特异性siRNA组(scr-siRNA组),HMGB1 siRNA组(siRNA组)。糖尿病成模后16周,siRNA组大鼠予以球内注射HMGB1 siRNA2μl,scr-siRNA组注射同等量的非特异性siRNA,NC组和DM组注射等量的无菌生理盐水。注射后一周进行各组大鼠视网膜的HMGB1的免疫组化定位和westernblot定量检测,TUNEL法检测视网膜细胞凋亡情况,通过荧光血管造影和视网膜电图检测大鼠视网膜血管和功能情况。体外部分:对视网膜血管内皮细胞进行转染HMGB1 siRNA,之后检测细胞活力、细胞凋亡、ROS产物情况,同时检测凋亡相关蛋白及HMGB1相关蛋白的表达。 结果:糖尿病的大鼠模型建立后,结果显示糖尿病组大鼠从第4周开始出现视网膜各层细胞排列紊乱,细胞密度降低,可见微血管病变,血管扩张,随着病程的延长,出现视网膜神经节细胞的水肿、变少、视网膜细胞排列紊乱和内、外核层的变薄,可见突破视网膜内界膜的血管内皮细胞。TUNEL检测发现随着病程的延长,凋亡阳性细胞数逐渐增多,与对照组相比,糖尿病4周、8周和16周的凋亡指数具有显著的统计学差异(t=3.873、5.794、12.037,P<0.05)。免疫组织化学染色显示实验初期HMGB1主要表达在视网膜神经节细胞核中,随着病变的进展HMGB1的表达增多,从视网膜神经节细胞层扩展到内、外核层,且分布有从细胞核向细胞浆中转移的趋势。western blot定量实验也证实HMGB1的蛋白表达呈现明显的时间依赖性增多的特点(t=3.252、39.504、14.773,P<0.05),HMGB1 mRNA的表达也呈现出同样的趋势(t=6.907、23.794、6.20,P<0.05)。体外部分,在细胞层面,CCK8结果显示高浓度葡萄糖可以抑制视网膜血管内皮细胞的活力,48小时和72小时的细胞活力与对照组相比具有统计学差异(t=5.098、6.095,P<0.05),同时HMGB1的蛋白表达呈时间依赖性增高(t=15.096、34.580、7.054,P<0.05)。 经免疫组织化学染色和western blot检测发现:与球内注射非特异性siRNA组相比,球内注射HMGB1 siRNA后可以明显减少HMGB1蛋白的表达(t=24.365,P<0.05),适用于进一步实验研究。TUNEL检测显示糖尿病组和非特异性siRNA组的凋亡指数明显高于正常对照组(t=3.508、7.665,P<0.05),HMGB1 siRNA组的凋亡指数较非特异性siRNA组降低(t=3.965,P<0.05)。荧光血管造影显示:高糖组和非特异性siRNA组大鼠视网膜周边毛细血管迂曲,可见血管闭塞及无灌注区,造影晚期可见荧光渗漏,HMGB1 siRNA组的视网膜血管闭塞情况得到改善,渗漏情况较非特异性siRNA组明显好转。电生理检测显示:HMGB1siRNA组的a波、b波的振幅均高于非特异性siRNA组(t=6.132、5.733,P<0.05),而非特异性siRNA组和高糖组的a波、b波振幅没有统计学差异(t=2.443、13.370,P>0.05)。 体外模型部分,我们先通过western blot检测以探明siRNA对HMGB1的沉默作用效率,结果显示HMGB1 siRNA组HMGB1蛋白表达水平与非特异性siRNA组相比降低了75%(t=3.348,P<0.05),而正常对照组和非特异性siRNA组之间无显著性差异(t=23.578,P>0.05),此模型适用于进一步研究。正常视网膜血管内皮细胞为贴壁细胞,形态为梭形,高浓度葡萄糖处理后细胞部分漂浮,体积变小,少量细胞变为圆形,HMGB1 siRNA转染后,细胞形态接近正常。经Hochest33342染色后,正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色,坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失。凋亡细胞核被染成亮蓝色,部分染色质浓缩,呈碎块状或半月形致密染色。经流式细胞仪检测,HMGB1 siRNA组细胞凋亡率与非特异性siRNA组相比显著下降(23.6±2.4%与47.6±1.98%,t=2.674,p<0.05)。CCK8检测显示:HMGB1 siRNA预处理可以提高HRECs的细胞活力。ROS检测显示:与正常对照组相比,高糖组和非特异性siRNA组ROS产量增加约50%,而两者之间差异无统计学意义(t=43.650,p>0.05)。HMGB1 siRNA转染可以抑制ROS产生盼增加趋势(t=29.037,p<0.05)。western blot检测发现HMGB1 siRNA预处理可以抑制cleaved-caspase3表达,提高Bcl2的表达。western blot检测显示高糖使IKKβ和NF-κ B的表达增加,HMGB1表达抑制后IKKβ和NF-κ B表达随之降低,HMGB1可能是通过IKKβ/NF-κ B信号通路发挥其作用的。 结论:HMGB1 siRNA可在体外和体内减轻高糖环境下视网膜细胞的损害和氧化应激水平,改善视网膜的功能,其作用可能是通过抑制HMGB1/IKKβ/NF-κB信号通路实现的。HMGB1可以作为糖尿病视网膜病变的新的治疗靶点。