论文部分内容阅读
第一部分MALAT1、miR-22-3p、ErbB3在胃癌及癌旁组织中的表达及对患者预后影响评估目的:探究MALAT1、miR-22-3p、ErbB3在胃癌及癌旁组织中的表达及对患者预后的影响。方法:选取37例确诊的胃癌患者,RT-PCR检测癌组织及癌旁组织内MALAT1、miR-22-3p及ErbB3 m RNA的表达水平。确定胃癌患者不同病理分期中MALAT1的表达水平;Pearson分析MALAT1、miR-22-3p与ErbB3之间的相关性。确定胃癌患者癌组织内MALAT1表达高低对患者生存期的影响性。结果:1.RT-PCR检测:相对于癌旁组织,胃癌组织内MALAT1及ErbB3高表达,miR-22-3p低表达,差异具有统计学意义（P＜0.05）。2.Ⅲ～Ⅳ病理分期内MALAT1的表达高于Ⅰ～Ⅱ表达,差异有统计学意义（P＜0.05）。3.MALAT1与miR-22-3p、miR-22-3p与ErbB3负相关性明显,MALAT1与ErbB3正相关性明显,差异具有统计学意义（P＜0.05）;4.MALAT1高低表达对患者生存期影响:MALAT1高表达组患者5年内的生存期比例明低于MALAT1低表达组患者,差异具有统计学意义（P＜0.0041）。小结:1.在胃癌病理发展中,MALAT1及ErbB3因子促癌性明显,miR-22-3p抑癌性明显,三者表达相关性显著。2.随着MALAT1在胃癌组织内表达增加,患者生存期逐渐缩短。第二部分MALAT1靶向miR-22-3p调控胃癌细胞增殖及凋亡机制研究目的:探究MALAT1差异性表达及其靶向miR-22-3p对胃癌细胞增殖及凋亡的影响。方法:选取胃癌细胞系SGC-7901及BGC-823作为研究对象,同时选取GES-1作为对照组,传代培养细胞,选取第三代单层细胞作为对象,对细胞进行MALAT1、miR-22-3p过表达及沉默处理;RT-PCR验证其转染效率;双荧光素酶基因检测MALAT1靶向miR-22-3p关系验证;RT-PCR检测MALAT1表达对miR-22-3p影响性;CCK-8及克隆实验检测各组细胞的增殖能力;Annexin V-FITC检测各组细胞凋亡能力;WB检测各组细胞Ki-67、PCNA及Cleaved Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白表达。结果:1.MALAT1过表达或者沉默调控胃癌细胞增殖及凋亡机制研究:两组胃癌细胞内MALAT1的表达高于正常胃细胞,差异具有统计学意义（P＜0.05）。MALAT1在两组胃癌细胞SGC-7901、BGC-823内得到成功过表达及沉默,差异具有统计学意义（P＜0.05）。当MALAT1在胃癌细胞SGC-7901内过表达后,细胞的增殖率提升,凋亡下降,当在胃癌细胞BGC-823被沉默后,细胞的增殖率下降,凋亡提升,差异具有统计学意义（P＜0.05）。当MALAT1在胃癌细胞内过表达后,Ki-67、PCNA、Bcl-2蛋白表达明显提升,Cleaved Caspase-3及Bax表达降低,而当MALAT1在癌细胞内沉默后,Ki-67、PCNA、Bcl-2蛋白表达明显降低,Cleaved Caspase-3及Bax表达升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）。2.MALAT1靶向miR-22-3p调控胃癌细胞增殖及凋亡机制研究:同正常胃部细胞GES-1相比,胃癌细胞系SGC-7901及BGC-823中miR-22-3p的表达降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。MiR-22-3p在两组胃癌细胞SGC-7901、BGC-823内得到成功过表达及沉默,差异具有统计学意义（P＜0.05）。双荧光素酶基因检测MALAT1、miR-22-3p靶向关系:MALAT1的3’非编码区预测到一个miR-22-3p的结合位点,充分构建了MALAT1的荧光素酶野生型wt-p GL3-MALAT1-3’UTR（WT-MALAT1）和突变型mut-p GL3-MALAT1-3’UTR（MUT-MALAT1）报告基因载体,分别与miR-22-3p模拟物共同转染到胃癌细胞内,结果显示两组胃癌细胞中的荧光素酶活性显著降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。MALAT1过表达可以降低miR-22-3p的表达,MALAT1的沉默则可以促进miR-22-3p的表达,差异具有统计学意义（P＜0.05）;当MALAT1在胃癌细胞内表达受到抑制后,细胞的增殖活性降低,凋亡增加,miR-22-3p表达受到抑制后,细胞增殖活性提升,凋亡降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。当MALAT1在胃癌细胞内过表达受到抑制后,Cleaved Caspase-3及Bax表达提升,Bcl-2表达降低;当miR-22-3p在胃癌细胞内表达受到抑制后,Cleaved Caspase-3及Bax表达降低,Bcl-2表达提升,差异具有统计学意义（P＜0.05）。小结:在胃癌细胞的生物活性变化中,MALAT1负向靶向miR-22-3p对胃癌细胞增殖活性及凋亡进行调控,MALAT1过表达降低miR-22-3p表达,最终抑制癌细胞的凋亡,促进癌细胞的增殖活性,给予临床研究提供基础。第三部分MALAT1通过miR-22-3p/ErbB3轴调控胃癌细胞增殖及凋亡机制研究目的:研究MALAT1通过miR-22-3p/ErbB3轴调控胃癌细胞增殖及凋亡机制,为临床研究提供理论基础。方法:选取胃癌细胞系SGC-7901及BGC-823作为研究对象,同时选取GES-1作为对照组,传代培养,选取第三代单层细胞作为对象,细胞进行MALAT1、miR-22-3p过表达及沉默处理。体外分析:RT-PCR检测胃癌细胞系SGC-7901和BGC-823中ErbB3 mRNA的表达;双荧光素酶分别验证MALAT1与miR-22-3p及MALAT1与ErbB3之间的靶向关系;CCK-8及克隆实验检测SGC-7901细胞的增殖能力;Annexin V-FITC检测SGC-7901细胞凋亡能力;WB检测各组细胞Cleaved Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白表达。体内研究:选取裸鼠制备裸鼠模型,探究MALAT1沉默表达对裸鼠瘤体体积及质量的影响性。结果:1.体外分析:胃癌细胞内ErbB3的表达高于正常胃部细胞,差异具有统计学意义（P＜0.05）。ErbB3的m RNA 3’非编码区预测到一个miR-22-3p的结合位点,当ERBB3-WT及ERBB3-MUT报告基因载体与miR-22-3p模拟物共转染时,与对照组相比,两组胃癌细胞中的荧光素酶活性显著降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。抑制MALAT1表达后,ErbB3及其磷酸化表达降低,抑制miR-22-3p后可以逆转ErbB3及其磷酸化表达降低的趋势;miR-22-3p表达受到抑制后,胃癌细胞内ErbB3及其磷酸化表达升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）。MiR-22-3p表达受到抑制后,细胞的增殖活性提升,凋亡降低,Ki-67、PCNA、Bcl-2蛋白浓度提升,Cleaved Caspase-3、Bax下降,ErbB3表达受到抑制可以逆转上述趋势;单纯ErbB3表达受到抑制后,胃癌细胞的增殖性降低,凋亡提升,差异具有统计学意义（P＜0.05）。2.体内实验:SGC-7901细胞在注射裸鼠中呈时间依赖性增加,随着术后时间的延长,两组裸鼠的瘤体体积及瘤体重量均体现出增加的趋势,抑制MALAT1表达组裸鼠的瘤体体积及瘤体重量均较对照组降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。MALAT1可以促进裸鼠肿瘤的发展,促癌性明显,与之前研究结论一致（P＜0.05）;MALAT1表达受到抑制后,miR-22-3p表达升高,ErbB3表达下降,差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论:体外实验及体内动物模型中,MALAT1靶向miR-22-3p/ErbB3轴对胃癌细胞增殖、凋亡以及瘤体体积产生调控,MALAT1表达受到抑制可以明显促进miR-22-3p表达,抑制ErbB3活性,抑制胃癌细胞增殖活性,促进凋亡,最终抑制肿瘤体积的生长,为临床研究胃癌病理机制提供一定启发。