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目的:以往研究证实肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)能够诱导髓核细胞凋亡。17β雌二醇能抑制细胞凋亡的功能也得到了广泛的证实。PI3K/Akt途径是抑制细胞凋亡的细胞传导通路。本研究的目的是探索17β雌二醇能否通过PI3K/Akt途径抑制肿瘤坏死因子-α诱导的人髓核细胞凋亡。方法:用人髓核细胞株进行培养,按照以下处理条件进行实验分组,每组为6个样本。Ⅰ组(对照组):未对人髓核细胞进行特殊处理;Ⅱ组:用TNF-α(100 ng/ml)对人髓核细胞进行干预;Ⅲ组:用17β-E2(10μm/L)预先处理后加入TNF-α(100 ng/ml)对人髓核细胞进行干预;Ⅳ组:用17β-E2(10μm/L)和MK2206(10μm/L,PI3K/AKT途径抑制剂)同时预先处理后加入TNF-α(100 ng/ml)对人髓核细胞进行干预。分别从细胞形态学、蛋白分子和核酸分子水平对人髓核细胞凋亡情况进行评估,运用:1倒置相差显微镜对人髓核细胞进行形态学观察;2流式细胞学对人髓核细胞的早期凋亡率进行定量分析;3细胞增殖活性检测(CCK-8)对人髓核细胞的增殖活性进行定量分析;4用caspase-3活性检测试剂盒检测人髓核细胞中caspase-3蛋白活性;5用蛋白印迹法(Western blot)对人髓核细胞中pro-caspase-3、caspase-3/P17、cleaved PARP,PARP、Akt和p-Akt蛋白表达进行定量检测,以相对灰度值(/GADPH)表示;6用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法对人髓核细胞中caspase-3/p17、PARP和Akt mRNA表达进行定量检测,并且以相对ct值(/GADPH)表示。结果:1人髓核细胞呈现出多角形生长,且轮廓明显,细胞核呈现出圆形以及椭圆形,细胞可在6-8小时贴壁生长,7-8天可进入对数生长期。2倒置相差显微镜,在Ⅰ组中,未见人髓核细胞出现明显凋亡;与Ⅰ组相比,Ⅱ组中可见人髓核细胞出现明显凋亡;Ⅲ组中,未见人髓核细胞出现明显凋亡;与Ⅲ组相比,Ⅳ组中可见人髓核细胞出现明显凋亡。3流式细胞学分析结果显示:Ⅰ组人髓核细胞早期凋亡率为12.05%±2.27%;Ⅱ组人髓核细胞早期凋亡率为30.8%±8.36%;Ⅲ组人髓核细胞早期凋亡率为13.81%±1.97%;Ⅳ组人髓核细胞早期凋亡率为30.01%±7.33%。Ⅰ组早期凋亡率明显低于Ⅱ组(p<0.001),Ⅱ组早期凋亡率明显高于Ⅲ组(p<0.001),Ⅲ组早期凋亡率明显低于Ⅳ组(p<0.001)。4用细胞增殖与活性检测(cck-8)结果显示:Ⅰ组人髓核细胞增殖活性od值为90.32%±3.25%;Ⅱ组人髓核细胞增殖活性od值为37.78%±3.28%;Ⅲ组人髓核细胞增殖活性od值为88.67%±2.87%;Ⅳ组人髓核细胞增殖活性od值为38.97%±3.49%。Ⅰ组细胞增殖活性明显高于Ⅱ组(p<0.001),Ⅱ组细胞增殖活性明显低于Ⅲ组(p<0.001),Ⅲ组细胞增殖活性明显高于Ⅳ组(p<0.001)。5用caspase-3活性检测试剂盒来检测细胞中caspase-3蛋白活性,与Ⅰ组相比,Ⅱ组中人髓核细胞在tnf-α干预下caspase-3蛋白活性增加3.9倍,Ⅲ组中,在17β-e2预处理后人髓核细胞的caspase-3的活性增加1.1倍,而Ⅳ组,在17β-e2和mk2206预处理后caspase-3蛋白活性增加3.7倍。Ⅰ组和Ⅱ组、Ⅱ组和Ⅲ组、Ⅲ组和Ⅳ组之间有统计学差异(p<0.001)。6westernblot结果显示:四组(Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组)中caspase-3/p17蛋白的灰度值(/gapdh)分别0.13±0.01、0.39±0.01、0.12±0.01、0.38±0.01;四组中cleavedparp蛋白的灰度值(/gapdh)分别0.13±0.01、0.33±0.01、0.14±0.01、0.32±0.01;四组中pro-caspase-3蛋白的灰度值(/gapdh)分别0.40±0.01、0.11±0.01、0.38±0.01、0.12±0.01;四组中parp蛋白的灰度值(/gapdh)分别0.35±0.02、0.16±0.01、0.35±0.01、0.15±0.01;四组中p-akt蛋白的灰度值(/gapdh)分别0.14±0.02、0.30±0.01、0.43±0.02、0.13±0.02,以上蛋白的灰度值在Ⅰ组和Ⅱ组、Ⅱ组和Ⅲ组、Ⅲ组和Ⅳ组之间有统计学差异(p<0.001)。而四组中akt蛋白的灰度值(/gapdh)分别0.49±0.02、0.48±0.01、0.49±0.02、0.48±0.01,其组间差异无统计学意义。tnf-α干预后的人髓核细胞中p-akt蛋白的灰度值(/gapdh)在0到24小时内升高,而在24到48小时下调,24小时为p-akt的表达高峰(0.10±0.01、0.18±0.01、0.33±0.02、0.18±0.01、0.10±0.01),0时与12时、12时与24时、24时与36时和36时与48时之间有统计学差异(p<0.001)。但akt蛋白表达水平保持不变(0.48±0.01、0.48±0.01、0.49±0.02、0.48±0.02、0.49±0.01,P>0.05)。虽然,17β-E2干预后的人髓核细胞中p-Akt蛋白的灰度值(/GAPDH)在0到48小时内升高(0.06±0.01、0.15±0.01、0.25±0.02、0.33±0.02、0.44±0.01),以上蛋白灰度值各组之间均有统计学差异(P<0.001),但Akt蛋白表达水平保持不变(0.44±0.03、0.44±0.03、0.45±0.02、0.46±0.04、0.47±0.05,P>0.05)。7实时定量PCR检测结果显示:caspase-3/p17 mRNA的ct值(/对照组)分别2.45±0.23、0.98±0.15、2.50±0.13,四组中PARP mRNA的ct值(/对照组)分别0.30±0.03、0.95±0.03、0.27±0.04,以上mRNA的ct值在Ⅱ组和Ⅲ组、Ⅲ组和Ⅳ组之间有统计学差异(P<0.001)。Akt mRNA的ct值(/对照组)分别0.96±0.02、0.99±0.02、0.97±0.02,其组间差异无统计学意义。结论:肿瘤坏死因子-α诱导人髓核细胞的凋亡,17β-雌二醇可显著抑制髓核细胞的凋亡,这是通过激活PI3K/Akt途径实现的。