饮酒后伤害案件屡见不鲜,其中,饮酒后遭受轻度外力打击发生致死性蛛网膜下腔出血(traumatic subarachnoid hemorrhage,t SAH)的案例时有发生。如何界定饮酒在此类案件中的参与度,已成为法医鉴定工作迫切解决的难题。深入系统地研究饮酒对脑血管的损伤机制,将有助于对此类案件的科学鉴定。乙醇(ethanol,Et OH)又名酒精,是各种酒类饮品中主要的有效成分。对乙醇损伤机制的研究涉及各个方面,包括神经损伤、凝血障碍、血流及血管舒缩功能改变,但这些改变尚不足以解释饮酒后发生t SAH的原因。另外,乙醇在体内经过乙醇脱氢酶作用产生的一级代谢产物乙醛(acetaldehyde,ACA)也可能成为心脑血管系统损伤的潜在杀手。近年来,越来越多的研究证实,乙醛不仅是饮酒后诱发各类癌症的罪魁祸首,也是造成酒精性心脏病、酒精性肝病的主要毒性物质。生理情况下,脑血管自身具有自主调节功能,脑血管内皮细胞及平滑肌细胞在感受外界刺激后通过细胞间对话以维持正常的血管舒张与收缩功能,调节脑灌注,确保脑功能需求。但是,在急性及慢性乙醇累毒后,是否可通过改变脑血管内环境及损坏血管壁细胞导致脑血管功能与结构改变,其机制尚不十分明确。血管壁细胞不仅拥有乙醇脱氢酶等参与乙醇代谢,还含有NOX(NADPH oxidase)及NOS(nitric oxide synthase)等多种氧化酶,参与ROS/RNS生成与转化,同时也是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAS)的作用靶器官。尽管已有文献报道,乙醇可通过ROS、RNS、RAS等多途径参与调节心脑血管疾病,但是,关于饮酒后乙醇及代谢产物乙醛通过何种途径导致脑血管损伤,有待进一步探讨。本课题拟从饮酒后脑血管功能及结构异常为切入点,从以下三个方面研究乙醇的血管毒性作用及机制:(1)建立慢性饮酒大鼠模型,观察其脑血管功能及结构变化;(2)观察乙醇及代谢产物乙醛对血管内皮细胞及血管平滑肌细胞的毒性作用;(3)探讨氧化应激机制在乙醇及其代谢产物乙醛对血管内皮细胞及血管平滑肌细胞毒性中的作用。通过上述研究,探讨饮酒后轻度外力打击导致t SAH死亡的机制,为此类案件法医鉴定提供新的理论依据。第一部分饮酒对大鼠脑动脉功能及结构的影响目的: 过量饮酒可导致脑血管灌注压增加、脑血管扩张和血管通透性增加,使脑血管自稳态平衡破坏,并损害中枢神经系统。本部分研究拟通过制备慢性饮酒动物模型,观察脑基底动脉环舒缩功能及脑血管结构的变化,从动物整体水平明确饮酒对脑动脉功能与结构的影响,阐明饮酒的血管损伤靶点。方法: 1采用剂量递增自由饮酒模式(20%v/v酒-水溶液)持续饮酒12月,建立长期饮酒大鼠模型,并记录大鼠一般情况及体重的变化;2采用HE染色、Masson三色染色法和硫堇染色分别观察慢性饮酒大鼠脑血管和神经元形态结构的改变;3采用微血管张力仪检测长期饮酒大鼠脑基底动脉环乙酰胆碱(ACh)诱导的内皮依赖性和硝普钠(SNP)诱导的非内皮依赖性舒张反应的变化,以及血管紧张素(AngⅡ)、内皮素(ET-1)诱导收缩反应的变化,明确饮酒对血管舒缩功能的影响及其损伤靶点;4采用放射性免疫分析方法,检测长期饮酒大鼠血液中内皮素和血管紧张素水平的变化;5采用DHE染色法检测脑血管环活性氧,并采用免疫荧光染色及Western blot方法检测氧化应激相关蛋白在脑血管环中的表达变化,以探讨氧化应激在饮酒造成脑动脉功能与结构改变中的作用。结果: 1慢性饮酒大鼠体重显著降低,倦怠少动,反应迟钝,毛发干涩;2慢性饮酒大鼠脑内小动脉及基底动脉血管管壁增粗,管腔变窄,壁/腔比明显增大,胶原成分增多,并可见海马神经元发生变性、坏死。3慢性饮酒大鼠脑基底动脉对ACh诱导的内皮依赖性舒张反应下降,SNP诱导的非内皮依赖性舒张反应无明显变化;0.1μM AngⅡ诱导的收缩反应性增强,而ET-1诱导的收缩反应无明显变化。4慢性饮酒大鼠血浆中肾素活性(PRA)和血管紧张素Ⅱ水平升高,内皮素-1含量无明显变化。5慢性饮酒大鼠脑基底动脉环ROS及NOX亚基p47 phox蛋白表达升高。小结: 本部分实验成功建立了慢性饮酒大鼠模型,并证实了长期大量饮酒可导致大鼠脑动脉重构,脑血管功能紊乱,并以内皮依赖性舒张功能下降为著。长期饮酒后肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活,ROS水平表达升高,提示持久的氧化应激造成内皮细胞的损伤是长期饮酒导致脑血管稳态失衡的重要因素之一。第二部分乙醇和乙醛对血管内皮细胞的毒性作用及机制目的： 乙醇可经肝脏乙醇脱氢酶(ADH)代谢为乙醛,并经乙醛脱氢酶(ALDH)代谢为乙酸。当超过机体代谢能力时,乙醇、乙醛在体内蓄积,对心脑血管等器官造成损伤。本部分研究拟采用人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC),从细胞水平观察乙醇和乙醛对血管内皮细胞的毒性作用及细胞死亡机制,并探讨氧化应激在其致损伤过程中的作用。方法： 1给予HUVEC细胞不同浓度、不同时间的乙醇和乙醛刺激,采用MTT检测HUVEC细胞生存率,观察乙醇、乙醛对HUVEC的细胞毒作用;2采用流式细胞术检测乙醇和乙醛处理后HUVCE细胞凋亡情况,明确乙醇、乙醛诱导HUVCE细胞死亡的方式;3采用透射电镜观察乙醇和乙醛处理对HUVCE细胞超微结构的影响;4采用共聚焦显微镜和Western blot方法观察乙醇和乙醛对HUVEC细胞微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达的影响,明确乙醇和乙醛诱导HUVEC细胞死亡的自噬机制;5采用Western blot方法检测乙醛对HUVEC细胞PI3K-AKT-m TOR和RAS-MEK-ERK通路中相关蛋白的表达变化,并使用ERK抑制剂PD98059预处理细胞,以阐明乙醛诱导HUVEC细胞发生自噬的信号机制;6采用特异ROS探针标记和荧光显微镜观察乙醇和乙醛处理后氧化应激产物的变化;并采用外源性过氧化氢(H2O2)和非特异性内源性ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)预处理细胞,以明确乙醛是否可通过激活ROS-ERK通路诱导HUVCE细胞发生自噬。结果：1乙醇和乙醛均使HUVEC细胞生存率呈时间、剂量依赖性下降,并且乙醛的毒性作用比乙醇更快、更强;2流式细胞术及透射电镜结果显示,乙醇(200m M)处理HUVEC细胞24h和48h,可见细胞发生早期凋亡,这些凋亡细胞的细胞核形态不规则,核染色质电子密度增高、边集呈半月状。乙醛(20μM)处理HUVEC细胞6h,细胞即发生非凋亡性细胞死亡。HUVEC细胞胞浆内出现较多双层膜结构的自噬体;3乙醛处理HUVEC细胞后,细胞骨架排列紊乱,胞体缩小,自噬标记性蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值呈现时间及剂量依赖性升高,而给予不同剂量的乙醇处理HUVEC细胞不同时间后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值无明显变化;4乙醛处理HUVEC细胞后,磷酸化ERK呈现时间依赖性表达升高,而p AKT/AKT、pm TOR/m TOR表达均无明显变化,给予ERK抑制剂PD98059预处理细胞后,可部分翻转乙醛诱导的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高;5乙醇和乙醛处理诱导的ROS增高呈现一过性,乙醇处理30min后ROS达顶峰,随后逐渐下降;乙醛诱导的ROS增高出现更早、幅度更高、持续时间更长,20min时ROS达峰值,50min后仍高于对照组;6给予外源性H2O2处理HUVEC细胞,可使磷酸化ERK表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著增加,给予非特异性内源性ROS清除剂NAC则可部分逆转乙醛诱导的磷酸化ERK水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高。小结：过量、持久的乙醇刺激可诱导HUVEC细胞发生凋亡;而乙醛则可以通过诱导HUVEC细胞产生大量的ROS,从而激活RAS-MEK-ERK通路快速诱导HUVEC细胞发生自噬,参与细胞损伤过程,而经典的PI3KAKT-m TOR通路在此过程中无明显作用。第三部分过量乙醇对人脑血管平滑肌细胞的毒性作用机制目的： 血管平滑肌细胞作为血管壁的主要细胞成分之一,在决定血管活性和血管结构中具有重要意义。本部分研究采用人脑血管平滑肌细胞(human brain vascular smooth cell,HBVSMC),从细胞水平观察乙醇对脑血管平滑肌细胞的毒性作用及其对细胞骨架结构的影响。方法： 1给予不同浓度的乙醇处理HBVSMC细胞,采用MTT法检测HBVSMC细胞生存率,以观察乙醇对HBVSMC的细胞毒作用;2利用流式细胞术和TUNEL法检测乙醇处理后HBVSMC细胞凋亡情况,明确乙醇诱导HBVSMC细胞死亡的方式;3观察乙醇处理后HBVSMC细胞的形态变化,并用鬼笔环肽特异性标记F-actin,Dnase标记G-actin,通过共聚焦显微镜观察不同时间、不同剂量乙醇对HBVSMC细胞骨架结构的影响;4提取细胞总蛋白,并分步提取HBVSMC细胞F-actin和G-actin蛋白,Weston blot方法观察HBVSMC细胞F-actin/G-actin比值、细胞收缩表型相关蛋白SM22α、丝切蛋白Cofilin及细胞缝隙连接蛋白Cx43表达的变化,进一步明确乙醇对HBVSMC细胞骨架结构的影响;5采用特异ROS探针标记和荧光显微镜观察乙醇处理后HBVSMC细胞氧化应激产物的变化。结果： 1使用不同剂量的乙醇(0-800m M)处理HBVSMC细胞24h,对HBVSMC细胞生存率的影响不明显,给予高于200m M乙醇持续刺激48h对HBVSMC细胞生存率有明显的抑制作用,呈现时间、剂量依赖性;2过量乙醇刺激可诱导HBVSMC细胞发生凋亡;3过量、持久的乙醇刺激后,HBVSMC细胞瘦长,细胞间缝隙增大,微丝排列分布及F-actin/G-actin比值无明显变化。乙醇对细胞收缩表型相关蛋白SM22α的表达无明显影响,但可以使丝切蛋白Cofilin表达升高,细胞缝隙连接蛋白Cx43表达下降;4乙醇处理可诱导HBVSMC细胞一过性ROS的产生。小结:过量、持久乙醇作用可诱导HBVSMC细胞发生凋亡,并使Cx43和Cofilin表达异常,但是细胞骨架整体结构未见明显改变,且SM22α表达水平及F-actin/G-actin比值无明显变化。另外,乙醇处理可能通过诱导HBVSMC细胞一过性ROS的产生,继而参与其凋亡过程。结论： 1长期大量饮酒可导致大鼠脑血管内皮依赖性舒张功能下降,肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活,ROS水平升高。因此,持久的氧化应激造成内皮细胞的损伤可能是长期饮酒导致脑血管稳态失衡的重要原因之一。2过量、持久的乙醇刺激可诱导血管内皮细胞发生凋亡;而乙醛则可以通过诱导内皮细胞产生大量的ROS,激活ERK快速诱导内皮细胞发生自噬,参与细胞损伤过程。3过量乙醇诱导血管平滑肌细胞ROS生成及Cofilin和Cx43表达异常,促进了平滑肌细胞的凋亡,加重了血管损伤。