目的:牙周炎是牙周支持组织的慢性感染性疾病,是危害人类口腔健康的主要疾病之一。重度牙周炎患者的深牙周袋面积可达72crrm2,是大量细菌及炎性因子的储库,可引起邻近及远隔组织器官的疾病。大量研究发现牙周炎与多种全身系统性疾病存在相关性,如心血管疾病、糖尿病、慢性阻塞性肺疾病、低出生体重儿等。近20年,一些学者开始关注牙周炎及其致病菌与恶性肿瘤的关系研究。目前已有多项研究报告了牙周炎及其致病菌与恶性肿瘤,尤其是口腔癌之间可能存在相关关系。Virchow认为肿瘤起源于慢性炎症位点,慢性炎症环境富含炎症细胞、生长因子、活化的基质和DNA损伤促进剂等,在这种环境下持续的细胞增殖可能加强和提升肿瘤发生的风险。P.gingivalis是一种革兰阴性厌氧杆菌,多在慢性牙周炎患者中检出,是毒力最强的牙周致病菌之一。P.gingivalis具有许多毒力因子,使细菌能够黏附于口腔表面,并侵入到宿主的牙周组织内,调控宿主细胞的免疫炎症反应。研究表明细胞内的P.gingivalis可以在不同水平对与细胞周期相关的某些分子发挥影响,如cyclin D1、cyclinE、CDK4/6等。可以缩短细胞周期,促进细胞失控性增殖。而恶性肿瘤最基本的特征是肿瘤细胞的失控性增殖。口腔癌是头颈部最常见恶性肿瘤之一,在口腔癌中90%为口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC),来源于口腔黏膜。而P.gingivali 最常存在于口腔的牙周组织中,可以定植在口腔表面,有学者研究发现P.gingivalis可促进口腔鳞癌细胞侵袭转移,并且可引起肿瘤细胞的间质样转化,但发现P.gingivalis刺激Ca9-22 口腔鳞癌细胞可轻度抑制细胞增殖,而另有学者研究发现P.gingivalis与具核梭杆菌共同作用于口腔鳞癌细胞可促进细胞增殖。Mai等对1252名绝经后女性进行队列研究发现龈下菌斑中P.gingivalis 与口腔癌发病率无明显相关性。P.gingivalis与口腔鳞状细胞癌的发生发展是否存在相关性仍存有争议,现有研究中能够直接说明P.gingivalis 与口腔鳞状细胞癌是否存在相关性的大样本研究较少,因此本研究首先在鳞癌组织中进行P.gingivalis的检测,并观察P.gingivalis感染对口腔鳞癌Tca8113细胞增殖的影响,对可能涉及的分子机制进行研究。为P.gingivalis与口腔鳞癌的发生发展是否存在相关性提供更进一步的证据,为口腔鳞癌的预防和治疗提供新方向。研究方法:本研究分为以下三个部分:1、临床样本中P.gingivalis的检测。收集61例口腔鳞癌及相应癌旁组织标本和30例全身健康且无牙周疾病者的正常口腔角化上皮组织标本,术前进行鳞癌患者的牙周检查。对参加者牙周临床指标和肿瘤临床病理参数进行分析。应用荧光原位杂交检测石蜡标本中P.gingivalis的阳性率,实时定量PCR(quantitive real-time PCR,qRT-PCR)检测各组织中P.gingivalis的DNA含量,并对其与鳞癌的临床病理参数进行统计学分析。明确牙周炎及P.gingivalis的存在与口腔鳞癌的发生发展有关。2、建立P.gingivalis感染口腔鳞癌Tca8113细胞模型,透射电镜观察细菌侵入细胞;CCK-8法检测细胞增殖情况;流式细胞仪检测细胞周期;应用qRT-PCR和western blot检测细胞周期关键调控因子cyclin Dl mRNA及蛋白表达;同时对其上游的转录因子AP-1(c-Jun、c-Fos)进行研究,并应用免疫组织化学方法检测临床组织标本中cyclin D1、c-Jun、c-Fos蛋白的表达。3、第三部分进行了P.gingivalis感染口腔鳞癌Tca8113细胞增殖机制的研究。首先应用芯片筛查P.gingivalis感染口腔鳞癌Tca8113细胞后差异表达miRNA,进一步通过抑制差异表达的miR-21,采用qRT-PCR和western blot观察其对靶基因程序性细胞死亡因子4(programmed cell death 4,PDCD4)表达的影响;过表达PDCD4观察其对转录因子AP-1(c-Jun、c-Fos)表达的影响;沉默c-Jun,采用qRT-PCR和western blot观察对miR-21及PDCD4表达的影响,研究其相互作用机制,同时观察对cyclin Dl mRNA和蛋白表达的影响。采用CCK-8法检测miR-21、PDCD4、c-Jun干扰后P.ggivalis感染对细胞增殖的影响。统计学处理:应用统计学软件SPSS17.0进行统计学分析。对于计量资料,均数用mean±SD表示,两组比较采用独立样本t检验,多组比较采用方差分析;计数资料比较采用X2检验;相关分析用spearman和pearson相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。实验结果:主要分为以下三部分1、口腔鳞癌患者牙周临床指标PD、AL及余留牙数与患者组织分化程度和淋巴结转移相关,即牙周炎越严重的患者其组织分化程度越差并淋巴结转移的发生率越高。应用DNA荧光原位杂交方法在口腔鳞癌、癌旁组织及正常组织中检测P.gingivalis的阳性率分别为60.7%、32.8%、13.3%,各组间差别有统计学意义(P<0.05),口腔鳞癌组织远远高于癌旁组织和正常组织,且癌旁组织高于正常组织。在鳞癌组织切片上可见细菌主要侵入到上皮层内,少量侵入到深部肌层。同时我们提取组织中细菌基因组DNA,应用绝对定量Realtime-PCR法,检测出组织中P.gingivalis DNA拷贝数,取其对数值进行统计发现鳞癌组织中P.gingivalis DNA含量远高于癌旁组织和正常组织,有统计学差异,且癌旁组织高于正常组织。分析发现鳞癌组织中P.giivalis与口腔鳞癌患者的组织分化程度及淋巴结转移有关。组织分化差及有淋巴结转移的患者P.gingivalis阳性率高。2、P.gingivalis感染Tca8113细胞后透射电镜观察可见细菌能够黏附并侵入口腔鳞癌细胞内。P.gingivalis感染Tca8113细胞后,CCK-8法检测可见细胞增殖,而细胞增殖与P.gingivalis感染细胞的感染复数(Multiplicity of infection,MOI)和感染时间有关,MOI为50:1时细胞增殖最明显且持续增殖时间最长。选择为本研究后续实验所用MOI值。同时可见细胞周期变化,S期细胞比例增加,G1期细胞比例降低,细胞可快速通过G1期;与细胞周期及肿瘤增殖相关的cyclin D1和AP-1(c-Jun,c-Fos)表达升高,并且在口腔鳞癌组织中检测到cyclinD1、c-Jun及c-Fos蛋白表达升高,与P.gingivalis感染成正相关。3、应用芯片筛查出P.gingivalis感染口腔鳞癌Tca8113细胞后差异表达miRNA,主要涉及 Ras signaling pathway、pathways in cancer、proteoglycans in cancer 及 MAPK signaling pathway和PI3K-Akt signaling pathway等多个与肿瘤发生发展相关的pathway。涉及的靶基因多与转录调节、表皮生长因子信号通路、细胞粘附等有关。这些信号通路在肿瘤的发生发展过程中起重要作用。对差异表达的miR-21我们进行了进一步的研究。在临床样本口腔鳞癌组织中miR-21表达高于癌旁组织及正常组织,有统计学差异(P<0.05)。P.gingivalis感染Tca8113细胞后,miR-21升高,而其靶基因PDCD4表达降低。抑制miR-21表达可反向调节靶基因PDCD4,过表达PDCD4可使c-Jun、c-Fos激活现象消失,应用siRNA沉默c-Jun可明显降低miR-21表达。而对miR-21,c-Jun和PDCD4的干扰可同时降低细胞周期蛋白cyclinD1表达及抑制细胞增殖。因此说明P.gingivalis感染引起的Tca8113细胞增殖及细胞周期蛋白cyclinD1表达增加可能是miR-21、PDCD4和AP-1形成的负反馈环路的调控作用。结论:本研究发现了 口腔鳞癌患者牙周临床指标PD、AL及余留牙数与患者组织分化程度和淋巴结转移相关。口腔鳞癌组织中P.gingivalis阳性率及DNA含量明显高于癌旁组织和正常组织,并与患者临床分期、鳞癌组织分化程度及淋巴结转移相关,且P.gingivalis阳性与口腔鳞癌中miR-21,c-Fos、c-Jun及cyclin D1表达成正相关。口腔鳞癌组织中miR-21表达高于癌旁组织及正常组织。同时揭示了P.gingivalis感染通过miR-21/PDCD4/AP-1负反馈环路调控口腔鳞癌Tca8113细胞增殖。说明P.gingivalis感染与口腔鳞癌的发生发展密切相关,为口腔鳞癌的预防及治疗提供了新视角。