背景与目的脑卒中是世界范围内致死和致残的主要疾病之一,其中急性缺血性是最主要的类型,发病率约占脑卒中的60-80%,其高发病率、高复发率、高致残率、高死亡率严重威胁着人类的生活质量。在过去几十年中,神经科学界一直致力于研究脑卒中的治疗方法,也在动物实验中发现了许多令人振奋的有效治疗手段,比如亚低温治疗,缺血预适应,干细胞治疗,神经保护剂,神经营养因子,一氧化氮,经颅激光治疗,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等。VEGF具有保护神经细胞、促进神经发生和神经突再生、促进血管生成恢复缺血脑组织血流灌注和帮助缺血性脑损伤后修复的作用,是一种很有前景的治疗缺血性卒中药物。然而,许多基础和临床前试验证明了VEGF治疗缺血性卒中的高风险收益比,并因此阻碍了VEGF进入卒中治疗的临床试验。造成高风险收益比的一个重要原因是其严重的副作用,即加重卒中后血脑屏障的渗漏、脑水肿以及出血转化。血脑屏障是神经血管单元的一个重要元素,它在维持中枢神经系统内环境的稳定中起关键作用。缺血性脑卒中发生后,血脑屏障被破坏,导致许多对神经系统有害的血清蛋白、炎性细胞等进入大脑,进一步加重缺血损伤。预防和阻止VEGF力重血脑屏障破坏和脑水肿有助于降低VEGF治疗卒中的风险收益。为此,我们必须厘清VEGF加重血脑屏障破坏的机制。方法将C57BL/6小鼠分为三组：假手术(Sham)组、大脑中动脉闭塞(middlecerebral artery occlusion, MCAO)模型组和VEGF组,Sham组小鼠进行造模手术,但线栓未堵住大脑中动脉开口处,MCAO组小鼠进行MCAO模型手术,复灌3h后梗塞侧脑室注射PBS, VEGF组造模复灌3h后于梗塞侧给予VEGF。为验证VEGF对缺血性脑卒中后血脑屏障渗透性的影响及对卒中预后的作用,我们测定了卒中24小时后伊文斯蓝(Evans Blue, EB)渗漏量、免疫球蛋白(immunoglobulin, IgG)渗漏量、脑水肿的程度、梗死体积(TTC法)、改良的神经功能缺损评分(nodified Neurological Severity Scores,mNSS)、贴纸去除试验以及加速滚轴试验。为了探索VEGF影响血脑屏障完整性的机制,我们应用包含39430个编码基因的小鼠基因表达谱芯片SurePrint G3 Mouse Gene Expression 8x60K Microarray检测VEGF对卒中后基因表达的影响,试图在这些基因当中找到与血脑屏障完整性相关的基因从而进一步分析机制。两组间信号比值(Fold Change)≥2或<0.5,且组间P值<0.05的则判定为有显著性差异。之后我们通过实时定量PCR验证了基因芯片的部分结果,并通过生物信息学方法找出可能的调控通路。结果三组间右侧大脑半球(缺血侧)的EB渗漏量、IgG渗漏量和脑组织含水量有显著差异,MCAO组显著高于Sham组,而VEGF组显著高于MCAO组。梗死体积、加速滚轴试验和mNSS评分MCAO组和 VEGF组间无显着差异。芯片结果显示脑缺血显著影响了3381个基因的表达,而VEGF组与MCAO组相比较38个基因表达出现了显著变化,这38个基因中有15个在MCAO组与Sham组的比较中也有改变,它们的功能涉及到细胞分化、调节免疫系统反应、急性期应答等等。在这15个基因中,血清类黏蛋白(orosomucoid, ORM)是与血脑屏障通透性明确相关的基因,也是变化最明显的。本实验应用实时荧光定量PCR、免疫印迹(Western blotting)、免疫组化和免疫荧光证实了ORM1 (ORM最主要成员)表达的变化。生物信息学分析显示ORM1启动子上有2个NF-κB的结合位点,我们应用凝胶超迁移实验证实了NF-κB可以结合于ORM1启动子。凝胶迁移实验结果显示VEGF抑制了NF-κB的DNA结合活性。此外,脑缺血诱导了经典NF-κB途径中的关键因子(IKKα、IKKβ、p-IKKα、IκBα、p-IκBα、p65、p-p65)表达升高,而VEGF抑制了它们的表达。结论VEGF加重了卒中后血脑屏障的破坏,通过抑制NF-κB通路的激活而下调血清类黏蛋白的表达是其中可能的机制之一。