肿瘤仍然是威胁人类健康的重要“杀手”，对肿瘤治疗新方法的研究一直是，并在将来的很长一段时间仍然会是医学和生命科学研究的重点。众多证据表明，肿瘤是一种体细胞遗传病，其遗传物质发生了变化，肿瘤基因治疗是在DNA或RNA水平的一种全新的肿瘤治疗手段，有可能会成为最终治愈肿瘤的方法。载体影响基因导入和表达的效率，是决定肿瘤基因治疗成败的关键因素，可分为病毒载体和非病毒载体，病毒载体又可分为复制型载体和非复制型载体。传统的病毒载体是非复制型的，以确保在体治疗的安全性。近年来，随着现代生物学和医学技术的发展，人们陆续构建和发现了一些病毒，能够选择性地在肿瘤细胞中复制并裂解肿瘤细胞，这类病毒被称为溶瘤病毒。溶瘤病毒应该具有靶向性，即对正常组织不感染或很少感染，或基本上不在正常组织中复制，但能够以较高效率感染和裂解肿瘤细胞，并在瘤块中扩散。溶瘤病毒有多种，目前研究较多的有溶瘤型的腺病毒、单纯疱疹病毒和人呼肠孤病毒等。 溶瘤型的单纯疱疹病毒载体在肿瘤治疗方面具有宿主范围广、感染效率高和可携带大片段外源基因等优点，目前报导的溶瘤型单纯疱疹病毒基本上可分为两种。一种缺失了编码核苷酸代谢过程中必须的酶的基因，而肿瘤细胞由于增殖迅速，富含这类酶，这些病毒必须借助肿瘤细胞中的酶进行复制。另一种则以缺失了神经毒力和凋亡抑制基因icP洲.万为基础。ICP34.5蛋白防止宿主细胞在病毒感染后，由干扰素一蛋白激酶R途径诱发的凋亡反应，而在肿瘤细胞中，这条途径往往是缺陷的，有证据表明，这种缺陷与癌基因ras突变相关。icP了4.，缺失的单纯疙疹病毒在正常细胞中诱发凋亡反应，但在上述的肿瘤细胞中增殖，从而达到靶向性溶瘤的目的。 传统的重组病毒的构建采用在敏感细胞中同源重组的方法，这种方法效率很低，耗时耗力;而以细菌人工染色体技术为基础的重组方法则快捷、准确得多，而且研究表明，与野生型病毒相比，细菌人工染色体中整合的病毒的大部分生物性状未变。这样，我们计划利用细菌人工染色体重组技术作为平台，构建新的溶瘤型重组病毒。 我们用基因工程方法，构建了两株有溶瘤效应的HSV一突变体:1.用传统的同源重组方法，构建了缺失凋亡抑制基因jcP34.5的突变型单纯疤疹病毒mtHSV。mtHSV基因组中，大部分了cP34.5基因的编码序列被大肠杆菌p一半乳糖昔酶(lac力基因取代。mtHSV感染Vero细胞后，可在含X一gal的软琼脂培养基上形成蓝色空斑。mtHSV经lacZ表达筛选纯化，经PCR和Southern杂交鉴定外源基因插入准确。2.用RecA依赖的同源重组方法，构建了一株以细菌人工染色体BAC为基础的、rr基因缺失的突变型单纯疤疹病毒HSVI一△rr一V1，并插入了绿色荧光蛋白EGFP基因作报告基因，HSVI一△rr一V1经过两次同源重组构建成功，用PCR和测序方法进行鉴定，证明构建正确。另外，我们从人胎盘组织中用RT一PCR方法克隆了内皮抑制素基因endo时时z’n，并将它插入中间质粒，构建转移载体，用RecA依赖的同源重组方法，构建了一株以BAC为基础的、rr基因缺失，同时携带有endostatz’n的突变型单纯疙疹病毒HSVI一EN一△rr，HSVI一EN一△rr的结构尚有待鉴定。 我们进一步用常规的病毒学方法研究了mtHSV在培养细胞上的增殖和溶瘤特性。mtHSV在Vero细胞内扩增，滴度可达1丁PFU/ml，略低于野生型病毒的增殖速度。该重组病毒可以感染人神经胶质瘤U251细胞、人膀肤癌EJ细胞、人肝癌Hep一3B、和小鼠肉瘤S一180细胞等多种肿瘤细胞，并在其中选择性复制:细胞毒性试验表明，mtHSV对上述几种肿瘤细胞的杀伤效率较高，但对人肺腺癌 A549，人肺癌SPC一Al和正常人羊膜Wish细胞的生长无影响。资料表明，对IntHSV敏感的肿瘤细胞，均是ras基因突变的。另外，试验表明，由于mtHSVtk基因完整，对抗疙疹病毒药物安昔洛维(ACV)敏感性并未降低，在临床使用时，可用药物控制其毒副作用。 我们以荷S一180瘤株的小白鼠为实验对象，研究了mtHSV在免疫完全(immun。一competent)的Balb/。小鼠体内的杀瘤效应。采用一次性瘤内注射的方法进行治疗，分别测试了小鼠的生存期、肿块体积、重量、重要器官的病理变化等指标。动物试验表明，m旧SV具有良好的杀瘤效力，对照组的平均生存期为34天，而早期治疗组和中期治疗组的荷瘤小鼠的生存期分别为55.8和47.6天;荷瘤第24天时，对照组的肿瘤平均体积为562.6~3，而早期治疗组和中期治疗组分别为306.5~3和422.3 mm3。对治疗组小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑及肿瘤组织作病理检查，发现除肿瘤组织有坏死外，其他组织无异常;提取各组织的DNA进行PCR扩增，仅在治疗小鼠的肿瘤DNA中扩增出icP34.5基因的带:免疫组化检测表明，仅在治疗肿瘤组织中有HSV-1抗原表达;电镜照片显示，在治疗小鼠肿瘤中有直径与HSV-1相同的病毒颗粒。总的说来，早期治疗组的治疗效果优于中期治疗组，中期治疗组的效果优于晚期治疗组，在中期治疗组内，高剂量治疗组效果优于其它两组。 在mtHSV对培养的人癌细胞的杀伤效应实验和对普通小鼠肿瘤模型治疗试验的基