论文部分内容阅读
肾细胞癌（Renal Cell Carcinoma,RCC）,也称之为肾癌,是泌尿系统中的高发肿瘤,在人群中的发病率持续升高。早期局限性肾癌外科手术治疗效果良好,可以达到治愈的目的,而晚期肾癌目前还缺乏有效的治疗手段。虽然目前靶向药物对晚期肾癌有一定的治疗效果,但是价格昂贵,副作用大,且极易产生耐药。因此对肾癌进展和靶向药物耐药的研究具有重要意义。磷酸烯醇丙酮酸羧激酶2（PCK2）是细胞内糖异生关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(（PEPCK）的线粒体亚型。近年来,越来越多的研究报道了PCK2在多种恶性肿瘤中的促癌作用,但是在肾癌中鲜有报道。在本论文中,我们研究发现PCK2启动子区的甲基化导致它在肾癌中的表达量降低,并且PCK2的表达水平与肾癌的诊断和预后均密切相关,是患者独立的预后影响因素;在肾癌中恢复PCK2的表达可以促进细胞内质网应激反应,抑制肾癌的进展和sunitinib耐药。本研究主要分为三个部分来阐释。第一部分:PCK2在肾癌中的表达变化及其表达水平与肾癌诊断、患者预后的相关性研究目的:明确PCK2在肾癌组织与正常组织中的差异表达,分析PCK2的表达水平与患者总体生存期的相关性。方法:1.通过TCGA和Ocomine数据库,分析PCK2在肾癌组织中m RNA的表达差异,并分析PCK2的m RNA相对表达水平与肾癌患者的总体生存期（OS）的关系;单因素和多因素Cox回归分析PCK2的表达水平是否是患者预后独立的影响因素;进一步分析PCK2的表达水平与肾癌患者临床特征的相关性。2.通过实时定量PCR（RTq PCR）、Western blot和免疫组化（IHC）等实验技术,在肾癌临床样本和肾癌细胞系中进一步验证PCK2的m RNA和蛋白表达变化。结果:1.对TCGA数据库中的KIRC数据集进行统计学分析发现,相对正常组织,PCK2的m RNA水平在肾癌组织中明显降低,并且这种低表达水平预示着较差的生存期。2.ROC曲线显示PCK2的表达水平对于肾癌的辅助诊断有意义。3.通过q RT-PCR和Western blot实验,我们检测了PCK2在肾癌细胞系和肾癌临床标本中蛋白和m RNA的表达水平,进一步验证了PCK2在肾癌中表达水平是降低的。同时,肾癌患者临床标本的免疫组化染色分析也显示PCK2在肾癌组织中表达降低,结果与前面所述的一致。结论:相比正常组织,PCK2在肾癌中表达降低,并且其表达水平与肾癌的诊断和预后均有明显相关性,肾癌中PCK2的表达可以作为肾癌预后独立的影响因素。第二部分:PCK2的表达变化对肾癌细胞生物学行为的影响（体内、体外实验）目的:研究PCK2的表达变化对RCC细胞生物学行为的影响。方法:1.构建稳定过表达PCK2的RCC细胞系,并通过q RT-PCR和Western blot实验验证细胞系中质粒稳定过表达的效果;通过在PCK2稳定过表达的RCC细胞系中进行细胞增殖实验、平板克隆形成实验、细胞划痕实验和Transwell细胞侵袭、迁移实验等细胞功能学实验,探索PCK2的表达变化对RCC细胞生物学行为的影响。2.建立肾癌Sunitinb耐药细胞系,对比Sunitinib耐药细胞和亲代细胞PCK2表达量的变化;用梯度浓度的Sunitinib刺激亲代细胞,Western blot实验分析PCK2表达量的变化;分别在亲代细胞和耐药细胞中过表达PCK2,然后用梯度浓度的Sunitinib处理,分析PCK2的表达变化是否会影响RCC细胞对Sunitinib的敏感性。3.将5-6周龄的BALB/c雄性裸鼠随机分为两组:Vector对照组和PCK2稳定过表达组,每组5只裸鼠。将构建好的PCK2稳定过表达的及其对照组的CAKI细胞培养收集后,在相应的裸鼠上进行皮下接种或尾静脉注射处理,观察PCK2在RCC细胞中的表达变化对细胞生长和转移能力的影响。结果:1.通过q RT-PCR和Western blot实验,我们检测了Vector对照组和PCK2过表达组细胞的m RNA和蛋白水平,结果显示PCK2过表达组细胞的m RNA和蛋白水平显著升高。这说明了PCK2过表达慢病毒转染和表达的有效性;细胞增殖实验、克隆形成实验、划痕实验和Transwell细胞迁移侵袭实验结果显示,在RCC细胞中过表达PCK2,细胞的增殖、迁移和侵袭能力均有明显减弱。2.q RT-PCR和Western blot实验结果显示,相比亲代细胞系,RCC耐药细胞系中PCK2的m RNA和蛋白水平显著降低;用浓度呈梯度升高的Sunitinib处理RCC亲代细胞,Western blot结果显示细胞的PCK2蛋白水平也随之升高;在RCC亲代细胞和耐药细胞中分别过表达PCK2,细胞活力检测实验显示两者对sunitinib的敏感性都有增加。3.裸鼠皮下成瘤实验结果显示,过表达PCK2后,肿瘤的生长速度减慢;尾静脉注射肿瘤转移实验结果显示,过表达PCK2后,肿瘤的转移能力减弱。结论:PCK2在肾癌中的低表达状态可以增强细胞的增殖、迁移和侵袭能力以及对Sunitinib的耐药性,有利于肾癌的进展;过表达PCK2可以抑制肾癌的进展以及对Sunitinib的耐药性。第三部分:PCK2在肾癌中表达下调及其对肾癌生物学行为影响的机制研究目的:探索PCK2在肾癌中表达下调及其影响RCC细胞增殖、迁移和侵袭能力以及对Sunitinib耐药性的机制。方法:1.通过在线数据库,分析PCK2在肾癌中表达下调与PCK2启动子区DNA甲基化的关系;收集5对肾癌临床标本（肾癌、癌旁）,BSP克隆测序（Bisulfite Sequencing PCR,BSP）和甲基化特异性聚合酶链反应实验（Methylation-Specific Polymerase Chain Reaction,MSP）分析肾癌组织细胞中PCK2启动子区甲基化水平的变化;用去甲基化药物5-AZA处理肾癌细胞或构建特异性的CRISPR/d Cas9基因编辑系统感染肾癌细胞,将PCK2启动子区去甲基化,观察PCK2在肾癌细胞中的表达变化。2.用GSEA富集分析和GO分析等生信分析法研究PCK2的功能相关通路及蛋白互作网络;通过q RT-PCR、Western blot实验和细胞内质网荧光探针成像实验研究PCK2的的表达变化对细胞内质网应激状态的影响;用内质网应激抑制剂TUDCA处理肾癌细胞（PCK2过表达组及其对照组,PCK2特异性去甲基化组及其对照组）做回复实验,研究PCK2的表达变化引起的肾癌细胞内质网应激状态的改变对细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果:1.通过在线数据库（http://www.urogene.org/）的分析结果显示,PCK2启动子区的转录起始位点至2300bp的DNA序列可见明显的Cp G岛分布,这提示PCK2可能受到启动子区DNA甲基化过程的调节;BSP和MSP实验结果显示,相对于正常组织,在肾癌组织细胞中PCK2启动子区的甲基化水平明显增高;回复实验的结果显示,用去甲基化药物5-AZA处理肾癌细胞或构建特异性的CRISPR/d Cas9基因编辑系统感染肾癌细胞,将PCK2启动子区去甲基化,PCK2在细胞中的m RNA和蛋白表达水平都明显升高。2、GSEA富集分析的结果显示PCK2跟肾癌细胞内三大基础代谢（糖代谢、脂代谢和氨基酸代谢）具有高度的相关性,进一步生信分析的结果显示PCK2的表达跟细胞内质网应激反应密切相关;q RT-PCR、Western blot实验结果显示,在RCC亲代细胞和耐药细胞中过表达PCK2,跟内质网应激相关的标志物表达量发生明显改变,提示细胞内质网应激反应的增强,细胞内质网荧光探针成像实验结果显示,在RCC细胞中过表达PCK2,可见明显的内质网应激反应的增强;用内质网应激抑制剂TUDCA处理肾癌细胞（PCK2过表达组及其对照组,PCK2特异性去甲基化组及其对照组）,实验的结果显示,PCK2过表达引起的肾癌细胞内质网应激反应的增强可以减弱肾癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。结论:PCK2在肾癌中的表达降低是其启动子区DNA甲基化水平增高导致的;过表达PCK2通过增强肾癌细胞内质网应激反应减弱肾癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。