缺血性脑卒中是危害人类健康的难治性疾病,具有高发病率、高致残率和高死亡率的特点。临床上所用的药物主要有：溶栓药,抗凝药及神经保护药。首选治疗措施仍然是溶栓治疗,但这一措施却因造成脑缺血再灌注,使缺血组织的病理损害进一步加重。因此,研究缺血再灌注损伤的神经保护具有重要意义。匹诺塞林是中国医学科学院中国协和医科大学药物研究所研制的一种新型脑保护一类新药,主要治疗缺血性脑卒中,目前Ⅰ期临床实验已经结束。前期研究表明,匹诺塞林能保护神经血管单元,具有保护线粒体、减少细胞内钙离子超载、抗氧化应激、抗炎等作用,并能够调控细胞凋亡通路。这些研究结果提示匹诺塞林可能是一个多靶点的药物。近年来,内质网应激与脑缺血再灌注损伤的关系成为研究热点,脑缺血再灌注损伤病理过程复杂,在病理反应的不同阶段,存在细胞内钙稳态失衡、氧化应激损伤、炎症反应等,各种因素可能存在交互作用,或顺序、或并行,贯穿整个病理发展过程,并由此可引起内质网应激发生,导致蛋白质翻译水平下降和诱发细胞凋亡,此外,内质网应激可能会对线粒体功能产生影响,导致线粒体功能障碍。本研究利用MCAO/R大鼠模型,探讨匹诺塞林在不同再灌注时间点的治疗作用,并探讨其作用机制是否与内质网应激导致的神经细胞凋亡有关。第一章匹诺塞林与脑缺血再灌注损伤本章根据已有资料,介绍研究背景和立体依据。匹诺塞林具有多种生物活性。本实验室前期的研究表明,其对急性局灶性脑缺血及再灌注、全脑缺血再灌注、慢性脑组织低灌注造成的损伤有治疗作用,并且能减缓多梗死性痴呆和阿尔茨海默病的发生发展。相关的机制研究表明,匹诺塞林能保护线粒体的结构和功能,并能降低兴奋性氨基酸的毒性,减少细胞内钙离子超载,调控细胞凋亡通路,还具有抗炎、抗氧化应激等作用,能保护神经血管单元。近年来,内质网应激诱发的细胞凋亡在脑缺血再灌注损伤病因机制中的作用成为研究热点。脑缺血/再灌注过程中细胞内Ca2+超载,活性氧(ROS)和一氧化氮(NO)产生,炎症反应的出现都是内质网应激发生的条件,剧烈或持久的内质网应激能激活凋亡信号通路,诱导细胞凋亡,加重脑缺血再灌注损伤。细胞内质网应激相关性死亡途径主要有三条：(1) Caspase-12的激活;(2) CHOP/GADD153转录激活：(3) c-jun氨基末端激酶(JNK)激活,诱导凋亡本章分析了脑缺血再灌注损伤、内质网应激与匹诺塞林的关系,为研究匹诺塞林对脑缺血再灌注过程中由内质网应激导致的细胞凋亡如何产生影响提供依据。第二章 匹诺塞林对实验性局灶性脑缺血再灌注损伤的治疗作用局灶性脑缺血再灌注后在不同脑区、不同细胞发展至不可逆损伤的进程是不同的。在本实验中,观察了脑缺血再灌注6h和24h后,从神经功能、组织形态学及炎症因子和神经损伤的生化标志物等方面考察缺血再灌注不同时间点的损伤程度及匹诺塞林的作用效果。结果发现,匹诺塞林对大鼠急性局灶性脑缺血2h再灌注6h和24h均显示了良好的治疗作用,且在1-10mg/kg范围内,具有剂量依赖性。主要表现为：(1)能够改善大鼠急性局灶性脑缺血再灌注造成的神经行为学障碍：(2)减小大鼠急性局灶性脑缺血再灌注的脑梗塞体积；(3)降低大鼠急性局灶性脑缺血再灌注的脑水肿百分比;(4)改善大鼠急性局灶性脑缺血再灌注的脑组织皮层、纹状体和海马神经元的形态;(5)降低大鼠急性局灶性脑缺血再灌注血清中NSE及S-1008水平；(6)降低大鼠急性局灶性脑缺血再灌注血清中炎症因子TNFa和IL-1p的水平。此外,本实验还发现,大鼠局灶性脑缺血2h再灌注6h脑组织损伤程度比再灌24h严重。以上结果再一次确证了匹诺塞林对脑缺血再灌注损伤的治疗作用,同时证明在脑缺血再灌注不同阶段均可产生作用。第三章 匹诺塞林对局灶性脑缺血再灌注大鼠半暗带内质网应激凋亡相关蛋白的影响局灶性脑缺血再灌注时,半暗带细胞出现凋亡。阻止半暗带细胞凋亡发展可能是减轻脑损伤的重要手段。本章选取局灶性脑缺血2h再灌注6h的大鼠作为研究对象,探索匹诺塞林是否通过调节内质网应激减弱半暗带细胞的凋亡。结果表明,匹诺塞林1mg/kg,3mg/kg, 10mg/kg三个剂量下,能剂量依赖性地：(1)减少大鼠半暗带细胞的凋亡：(2)增加半暗带GRP78蛋白的表达,并提高GRP78 mRNA水平；(3)降低半暗带内质网应激凋亡相关蛋白CHOP/GADD153、caspase-12的表达；降低CHOP/GADD153mRNA水平；(4)降低半暗带eIF2α磷酸化水平,减少ATF4的表达,降低ATF4mRNA水平;(5)升高半暗带Hsp70的水平;(6)升高半暗带Xbp-1mRNA水平。上述结果提示,匹诺塞林通过保护内质网功能,减少内质网应激凋亡蛋白表达,减少缺血半暗带细胞凋亡。第四章匹诺塞林对SH-SY5Y细胞损伤的保护作用及机制探讨本实验中,用内质网应激特异诱导剂Thapsigargin(毒胡萝卜素)和Tunicamycin(衣霉素)分别在SH-SY5Y细胞制作内质网应激模型,进一步观察匹诺塞林的抗凋亡作用,并探讨其对内质网应激凋亡相关蛋白的影响。也观察匹诺塞林对缺糖缺氧/复糖复氧损伤神经细胞的保护作用。结果发现,匹诺塞林在0.01μM至1μM浓度范围之间,能剂量依赖性的产生如下作用：(1)增加内质网应激条件下和缺糖缺氧/复糖复氧条件下的神经细胞活力,减少神经细胞凋亡;(2)增加内质网应激条件下和缺糖缺氧/复糖复氧条件下细胞GRP78、Hsp70的表达；(3)下凋内质网应激凋亡相关蛋白CHOP/GADD153、caspase-12的表达：(4)降低内质网应激条件下和缺糖缺氧/复糖复氧条件下细胞内钙离子浓度：(5)对PERK-eIF2a-ATF4-CHOP/GADD 153言号通路具有调控作用,能降低内质网应激条件下和缺糖缺氧/复糖复氧条件下eIF2α磷酸化水平和ATF4的表达;(6)在细胞水平上,匹诺塞林发挥最大效能的浓度在1μM到10μM之间。综上所述,脑缺血再灌注损伤是一个复杂的病理过程,匹诺塞林在再灌注早期就显示了良好的治疗作用,结合前期的研究结果,分析认为,匹诺塞林保护内质网功能,减少内质网应激凋亡蛋白表达是其治疗脑缺血再灌注损伤的主要机制之一,并且这过程可能要先于其线粒体保护、减少细胞内钙离子超载等作用的发生,这为下一步探寻其可能的作用靶点提供了新思路。