变形链球菌糖苷水解酶A联合应用溶菌酶抑制大鼠龋病发展的研究

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背景:龋病是一种慢性进展性细菌性疾病,发病隐匿,患病率高,导致牙体缺损,严重影响咀嚼等口腔功能,如不及时治疗,可能因菌血症而影响远隔器官,危害全身健康。WHO将龋病与癌症、心血管疾病并称人类三大重点防治疾病。寻求有效的防龋方法一直是国内外研究热点。变形链球菌(Streptococcus Mutans,MS)、血链球菌等众多细菌在牙齿表面形成的顽固而致密的菌斑生物膜是龋病发生的始动因素。目前的防龋方法主要有物理方法、化学方法和生物方法,其防龋机制主要是抑制菌斑生物膜中的致龋菌生长,虽然取得了一定效果,但是使用过程中都存在一定缺点。针对生物膜降解的防龋研究,可以在不破坏口腔微生态平衡的基础上阻断细菌黏附过程,应用前景广阔。本校微生物研究所从MS自身中提取一种糖苷水解酶A(Dextranase A,DexA),作用于生物膜基质的主要成分葡聚糖,体外研究可降解MS生物膜基质,减少MS菌斑生物膜的形成,具有潜在防龋作用。但其应用方法、浓度以及体内应用效果还有待进一步研究。目的:本研究旨在探究DexA使用方法以及对大鼠龋病发展的抑制作用,为DexA应用于临床防龋治疗提供理论依据。方法:体外研究:1、DNS法测定DexA酶水解底物生成的还原糖的量,确定DexA的体外酶活效率。2、接种MS至96孔板,建立MS生物膜模型,共设置4个分组:A组,DexA单独应用30min;B组,DexA联合应用溶菌酶(lysozyme,LYZ)30min;C 组,DexA 单独应用 60min;D 组,DexA+LYZ 60min。各组分别设置9个DexA酶浓度梯度,分光光度计检测各组吸光值,多组实验数据使用方差分析进行统计,其中两两比较使用SNK检验。3、以离体人牙釉质片为载体,人工唾液预处理后建立MS生物膜模型,设置4个分组:阴性对照组,应用无菌生理盐水(NS);DexA组,DexA单独应用60min;LYZ组,LYZ单独应用60min;联合应用组,DexA+LYZ60min。结晶紫染色观察釉质表面生物膜的染色深度。体内研究:Wistar大鼠25只,口腔接种MS、血链球菌、嗜酸乳杆菌,饲以高糖饮食,建立大鼠龋病模型。设置3个分组:NS组(阴性对照组),应用无菌生理盐水;NaF组(阳性对照组),应用0.2%氟化钠(NaF)溶液;DexA组,DexA酶联合应用LYZ。采用棉捻湿敷的方式,每周三次于大鼠右侧磨牙列应用相应药物30min,5周后处死动物,分离颌骨。菌落计数法检测各组MS细菌占比,Kyes龋齿计分法和micro-CT观察评估各组磨牙龋坏程度,多组实验数据使用方差分析进行统计,其中两两比较使用SNK检验。结果:体外研究结果:1、DexA酶作用约30min可将底物多糖完全水解。2、对于作用时间为 30min 的组,DexA 浓度为 0.5μM(P<0.01),1μM(P<0.001),2.5μM(P<0.05)时,DexA+LYZ联合应用的生物膜降解量显著大于DexA单独应用;对于作用时间为60min的组,DexA浓度为0.5μM(P<0.001),1μμM(P<0.001),1.5μM(P<0.001),2μM(P<0.01)时,DexA+LYZ联合应用的生物膜降解量显著大于DexA单独应用;在DexA浓度为0-2μM时,对于联合应用组,作用60min的生物膜降解量大于作用30min,但只有2μM浓度组观察到显著差异(P<0.05)。3、离体牙釉质片生物膜模型中,联合应用组生物膜染色深度最浅,浅于单独应用DexA或单独应用LYZ组。体内研究结果:1、所有动物均有龋齿发生,成功建立大鼠龋病模型。2、实验第五周,DexA组菌斑生物膜总菌落数明显小于NaF组和NS组(P<0.01),DexA组和NaF组MS水平明显低于NS组(P<0.05)。Kyes龋齿计分显示,DexA组窝沟龋Dm和Dx级计分均显著低于NS组(P<0.05),NaF组窝沟龋Dm级和Dx级计分均显著低于NS组(P<0.05),DexA组和NaF组窝沟龋各级计分无明显差异(P>0.05)。Micro-CT结果显示,NS组送检样本(上颌骨)磨牙出现明显龋洞。DexA组和NaF组送检样本(上颌骨)则无明显龋坏。结论:DexA酶联合应用LYZ有抑制大鼠龋病发展的作用,其效果与0.2%NaF溶液的抑制效果相当。DexA酶联合应用LYZ可能通过降解已经形成的菌斑生物膜以及抑制菌斑生物膜形成抑制龋病发展。
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