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黄病毒属于黄病毒科黄病毒属成员，是一类单链正义RNA病毒。该属病毒中包括很多重要的人类致病原，如登革热病毒(Dengue virus，DENV)、西尼罗病毒、日本乙型脑炎病毒、黄热病毒和蜱传脑炎病毒。黄病毒基因组RNA的复制在复制复合体中完成，该复制复合体由病毒编码的酶、无酶活性的非结构蛋白（nonstructural protein，NS）和宿主细胞因子共同组成，且与细胞膜偶联。许多无酶活性的非结构膜蛋白如NS2A、NS2B、NS4A、NS4B在复制复合体的形成过程中充当脚手架。迄今为止，对这四种非结构膜蛋白在病毒复制中的功能了解甚少。在本文中，我们以DENV-2为研究对象，旨在揭示NS4B在病毒复制中的作用，探究NS4B的二聚化能力以及阐释NS4A/NS4B相互作用的特征。 在揭示NS4B在病毒复制中的作用这部分研究工作中，我们以DENV-2NS4B为研究对象，在DENV-2全长感染性克隆系统中进行了系统的点突变研究。通过序列比对，我们总共选取了DENV-2 NS4B中46个保守的非丙氨酸位点，将相应位点的非丙氨酸突变为丙氨酸，再通过间接免疫荧光和噬斑检测来分析各个NS4B突变体的表型。结果显示30个NS4B突变体使病毒复制能力丧失，致死率约为65.2％;11个NS4B突变体不同程度地减弱病毒复制;5个NS4B突变体对病毒复制无影响。我们通过盲传实验获得了三组适应性突变体即NS4B(P50A+S59Y)、NS4B(R131A+S85P)和NS4B(L204A+A137V),它们可分别恢复原始NS4B致死突变体NS4B P50A、NS4B R131A和NS4BL204A的复制能力。通过DENV-2瞬时复制子实验，我们发现三组适应性突变分别通过拯救原始致死突变体的基因组RNA的复制能力而恢复病毒活力。 在探究NS4B的二聚化能力这部分研究工作中，我们首先建立了在大肠杆菌中表达和纯化可溶性DENV NS4B蛋白的方法。然后通过分子筛、化学交连反应及多角度散射检测等方法，发现体外重组表达的NS4B蛋白具有二聚化能力。通过免疫共沉淀实验，证实在HEK293T细胞中瞬时表达的NS4B蛋白也具有二聚化能力;另外用蛋白质印迹实验证实在DENV-2感染的细胞中NS4B能以二聚体形式存在。通过突变实验，我们发现赋予NS4B二聚化能力的功能区间主要是NS4B胞质环(130-165)及其羧基端序列(166-248)。反式互补实验表明致死的NS4B突变体RNA可在DENV-2复制子细胞系中利用存在于复制复合体中的野生型NS4B蛋白来恢复其复制能力，但不能利用瞬时表达的野生型NS4B蛋白或其他的NS4B致死突变RNA来恢复其复制能力。 在阐释NS4A/NS4B相互作用的特征这部分研究工作中，首先我们利用免疫共沉淀实验，证实在病毒感染的细胞和瞬时表达NS4A和NS4B的HEK293T细胞中NS4A可与NS4B相互作用。然后我们通过酶联免疫吸附实验证明体外重组表达的NS4A和NS4B蛋白间可发生直接的相互作用，并测定其结合解离常数Kd约为50nM。接下来，我们通过免疫共沉淀实验探寻赋予NS4A/NS4B相互作用的功能区间，结果表明NS4A(40-76)和NS4B(84-146)为主要的介导NS4A和NS4B蛋白相互作用的功能域。我们进一步解析了NS4A多肽(17-80)的NMR结构，发现NS4A多肽(17-80)可形成两个两亲的螺旋结构[螺旋α1(17-32)、螺旋α2(40-47)]和一个螺旋α3，其中螺旋α1和α2附着在内质网膜面向细胞质的那一侧，螺旋α3则穿越内质网膜。随后，我们通过NMR分析了在NS4A中可能参与NS4A/NS4B相互作用的氨基酸残基。我们对其中11个位于NS4A(40-76)多肽区间内且保守的氨基酸残基进行了点突变研究，结果表明这些氨基酸残基对病毒复制的影响不尽相同。结合免疫共沉淀实验，我们发现三个可影响NS4A与NS4B相互作用的NS4A点突变(L48A，T54A和L60A)使病毒复制能力丧失;相反，两个不影响NS4A与NS4B相互作用的NS4A点突变(F71A和G75A)则对病毒的复制无影响，这表明NS4A/NS4B间的相互作用与DENV-2病毒的复制在生物学上具有一定的相关性。 综上所述，本文的研究结果揭示了NS4B蛋白在病毒复制中的作用、DENV-2 NS4B蛋白的二聚化特性、NS4A/NS4B的相互作用特征及其与病毒复制的关系，这将有助于我们进一步了解黄病毒复制复合体的特征。本文中建立的表达和纯化膜蛋白的实验体系使进一步研究NS4B的生化特性及晶体学结构成为可能。NS4B蛋白的二聚化和NS4A/NS4B相互作用将可能成为潜在的抗病毒药物靶点，以用于抗病毒药物的研发。