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植物细胞细胞质内的游离钙离子浓度([Ca2+]cyt)精确调控了植物对昼夜节律的响应、生物钟基因的表达和钙依赖性蛋白的活性等多种生理反应。大量研究发现,随着时间的改变,[Ca2+]cyt产生昼高夜低的节律特性,并影响了气孔运动、花期转换及花粉管生长等生理活动。拟南芥AtCCaP1(Arabidopsis thaliana cytosolic Ca2+binding protein 1)是一种编码大量谷氨酸残基的基因。谷氨酸的双齿羧基可有效与钙离子发生金属配位反应。本课题利用启动子融合GUS基因、原位杂交和实时定量荧光PCR对AtCCaP1的表达模式进行分析,发现了该基因的表达具有昼低夜高的节律特性,以及在保卫细胞、表皮毛和花中表达的组织特异性。理化性质分析、Ca2+探针杂交和亚细胞定位等实验,验证了 AtCCaP1在细胞质内的钙结合特性。并通过CRISPR/Cas9和Gateway技术对AtCCaP1进行基因修饰,探究AtCCaP1对保卫细胞[Ca2+]cyt和气孔运动的影响。以及昼夜节律变化中[Ca2+]cyt和节律相关生理活动的潜在关系。主要研究内容与结论:1.AtCCaP1全长750 bp,由两个外显子和一个内含子组成的。CDS(Coding Sequence)长度为459 bp。经过PCR克隆得到了其完整的CDS序列,编码152个氨基酸残基,谷氨酸含量占比29.6%。生物信息学分析显示,AtCCaP1蛋白的分子量为16.628 KDa,等电点为4.03,预估半衰期为30 h,不稳定指数为90.05,归类于不稳定的酸性亲水蛋白质。2.通过分析AtCCaP1基因5’侧翼长度为1990 bp的序列,发现该区域含有大量生物与非生物胁迫元件、激素应答元件和转录因子结合位点在内的顺式作用元件。主要包括光响应、保卫细胞特异性、赤霉素响应和生长素响应元件等。整体多以光响应及生长发育相关的顺式作用元件为主。以拟南芥全基因组为模板,PCR克隆获得了包含AtCCaP1基因转录起始位点(Transcription Start Site,TSS)长度为1991 bp的5’侧翼序列。AtCCaP1启动子GUS融合实验显示,AtCCaP1主要在子叶顶端的叶肉细胞、真叶表皮毛、真叶保卫细胞、根、花、花药、花粉和柱头中表达,损伤条件下可探测到更强的GUS信号。截短型启动子GUS检测显示,随着AtCCaP1启动子长度的减少GUS信号越强。原位杂交显示,AtCCaP1的mRNA存在于真叶的叶肉细胞和保卫细胞中。AtCCaP1在生物钟基因突变体cca1/lhy/tocl中的表达不再具有节律性。上述结果提示,AtCCaP1的表达具有组织特异性,在完整启动子的调控下处于抑制状态。实时定量荧光PCR显示,AtCCaP1受到黑暗,赤霉素,损伤等条件的持续诱导。并且AtCCaP1的表达具有昼低夜高的节律性。3.构建His,GST融合标签原核表达载体,对AtCCaP1蛋白进行纯化。Stains-all和Quin-2钙结合探针染色结果显示AtCCaP1可与Ca2+结合。EMSA实验结果显示,AtCCaP1在Ca2+电泳体系下迁移率发生改变。构建GFP融合蛋白表达载体,并转染拟南芥叶肉细胞原生质体,亚细胞定位发现,AtCCaP1-GFP融合绿色荧光蛋白均定位于原生质体细胞质中。上述结果提示AtCCaP1作为细胞质中的钙结合蛋白可能影响[Ca2+]cyt。4.利用CRISPR/Cas9和Gateway技术分别获得了AtCCaP1敲除和过表达载体,鉴定构建了AtCCaP1敲除和过表达纯合株系。观察发现,黑暗条件下敲除株系气孔无法正常关闭,气孔开度与导度相较于野生型与过表达株系更高。过表达株系表型相反。在突变体中过表达AtCaP1可回复其气孔的突变表型。5.通过浸染获得稳定表达基因编码型Ca2+特异性探针R-GECO1的野生型和AtCCaP1突变体纯合株系。共聚焦激光扫描显微镜观察显示,持续黑暗1 h处理过程中突变体保卫细胞[Ca2+]cyt较野生型更高。原子吸收实验结果显示,3 h黑暗条件处理下突变体保卫细胞原生质体中的渗透物钾离子(K+)吸光值较野生型更高,通过非损伤微测技术(Non-invasive Micro-test Technique,NMT)发现,2 h黑暗条件下突变体保卫细胞中K+由外排变为内流。一氧化氮(NO)特异性荧光染料DAF-2DA染色显示,2 h黑暗处理时突变体保卫细胞中NO浓度高于野生型。综上所述,本研究验证了 AtCCaP1在细胞质中的钙结合能力、组织特异性和节律性。在AtCCaP1的敲除和过表达株系中进一步发现了 AtCCaP1直接调控黑暗条件下保卫细胞[Ca2+]cyt和气孔运动。NMT与原子吸收等技术也显示了突变体保卫细胞中关键差异离子种类。为深入了解昼夜节律钙震荡,黑暗诱导的气孔关闭机制提供了基础。