【摘 要】
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阿可拉定是一种高价值的异戊烯黄酮类化合物,对肝癌具有显著的治疗活性,被誉为继青蒿素之后中药的又一重大突破。阿可拉定软胶囊作为肝癌晚期治疗药物已于2022年1月份在中国获批上市。传统的酸碱水解法和化学合成法制备阿可拉定成本高、操作复杂且环境污染大。随着全球对绿色无污染制造的关注,基于蛋白酶催化的高效、绿色、温和的生物合成法广受关注。交联酶聚集体作为一种通用型固定化酶技术可克服游离酶催化效率低、难以重
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阿可拉定是一种高价值的异戊烯黄酮类化合物,对肝癌具有显著的治疗活性,被誉为继青蒿素之后中药的又一重大突破。阿可拉定软胶囊作为肝癌晚期治疗药物已于2022年1月份在中国获批上市。传统的酸碱水解法和化学合成法制备阿可拉定成本高、操作复杂且环境污染大。随着全球对绿色无污染制造的关注,基于蛋白酶催化的高效、绿色、温和的生物合成法广受关注。交联酶聚集体作为一种通用型固定化酶技术可克服游离酶催化效率低、难以重复使用、缺乏稳定性等不足。本研究通过交联酶聚集体手段将α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶共固定化,构建复合交联酶聚集体（combi-CLEAs）,成功实现了阿可拉定的高效一锅法制备。具体结果如下:（1）对多种朝藿定C水解酶进行活性筛选与分析,确定了两个用于阿可拉定酶法合成的活性糖苷酶。Talaromyces stollii CLY-6来源的重组α-L-鼠李糖苷酶Rha1（MT779021）与β-D-葡萄糖苷酶Glu4（MT779019）均可由毕赤酵母成功表达。其中,Rha1具有朝藿定C内侧鼠李糖苷键水解活性,比酶活可达6.67 U/mg;Glu4具有朝藿定C葡萄糖苷键水解活性,比酶活为8.43 U/mg。通过酶学性质的初步研究,两个糖苷酶拥有相同的最佳反应p H和相近的最适反应温度,有利于后续阿可拉定的一锅法制备。（2）基于交联酶聚集体技术,采用先硫酸铵聚集后戊二醛交联的方法分别固定α-L-鼠李糖苷酶Rha1和β-D-葡萄糖苷酶Glu4,获得了两个单一交联酶聚集体Rha1-CLEAs和Glu4-CLEAs。以酶活性恢复为基础,对硫酸铵浓度和戊二醛比例进行了优化,确定了最佳的固定化条件为:沉淀剂与蛋白质体积比1:1、戊二醛浓度0.2%。考察了CLEAs的温度和p H最适值、稳定性、动力学参数和重复使用性等。固定化酶比游离酶展现出更突出的耐热稳定性和p H稳定性。重复使用10次后,Rha1-CLEAs和Glu4-CLEAs均能保持60%以上催化活性。此外,通过二级结构分析确定了固定化的聚集过程在维持酶热稳定性中起了关键作用。（3）对Rha1和Glu4进行双酶共固定,获得了复合交联酶聚集体combi-CLEAs并成功将其应用于阿可拉定的一锅法制备。combi-CLEAs可催化0.5 mg/m L的朝藿定C在30 min内完全水解成阿可拉定。共固定化酶的催化性能与游离酶及两种单一CLEAs相比均有所提高。combi-CLEAs催化反应的阿可拉定得率分别是单一CLEAs混合物和游离酶混合物的1.18倍和1.45倍。另外,固定后Rha1和Glu4的糖耐受性有明显改善。糖耐受性的增强使得Rha1和Glu4在超高底物浓度下具有较高的催化活性。在100 mg/m L的朝藿定C条件下,阿可拉定得率可达77.45%,为工业化应用奠定了基础。
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