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背景与目的心肌在缺血基础上血流再灌注后损伤进一步加重,称为心肌缺血再灌注(ischemic reperfusion,I/R)损伤,常发生于心脏手术中,不但降低再灌注治疗的临床疗效,而且可能进一步加重心肌损伤和增加心力衰竭发生率,严重影响患者的心脏功能。而心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤是在体外研究心肌I/R损伤的理想模型,可以直接观察损伤的心肌细胞形态、代谢、功能等变化,普遍应用于I/R损伤的分子机制研究。外泌体(exosome)是新近发现的一种囊泡样小体,具有双层膜结构,其中包含丰富的蛋白质、脂类、微小RNA(micro RNA,mi RNA)等,可传输多种信号分子,是实现细胞间物质交换及信息传递的重要媒介。mi RNA是新发现的一类内源性小分子非编码RNA,可通过其下游的靶基因和信号通路,调控心肌细胞的凋亡过程,在心肌I/R损伤中发挥重要作用。本课题组前期研究结果表明mi R-133b-5p参与了吗啡预处理(morphine preconditioning,MPC)的心肌保护作用。鉴于前期的研究基础,本课题拟进一步探讨MPC诱导释放的血清外泌体对大鼠心肌细胞H/R损伤的作用和潜在的机制以及外泌体是否参与了MPC的心肌保护作用,为研究阿片类药物的心肌保护机制提供新的思路和理论依据。方法1.外泌体的提取与鉴定大鼠进行MPC或对照处理(CON)后,收集大鼠血清,采用Exo Quick?试剂盒提取血清中的外泌体,分别标记为MPC-Exo、CON-Exo。利用透射电镜和Western Blot进行外泌体鉴定,BCA法测定外泌体浓度。2.外泌体的标记与摄取将外泌体用Di I染料标记后加入细胞培养基中,与H9c2心肌细胞共培养12h,随后PBS洗涤和4%多聚甲醛固定,最后用荧光显微镜观察心肌细胞对外泌体的摄取情况。3.外泌体在MPC减轻心肌细胞H/R损伤中的作用H9c2心肌细胞随机分为对照组(Control)、缺氧复氧组(H/R)、MPC组(吗啡预处理组)、MPC+GW4869组(抑制剂组)、H/R+DMSO组(溶剂对照组)、H/R+GW4869组(抑制剂对照组)。Control组细胞置于DMEM/F12细胞培养液中常规培养;H/R组细胞给予5 h缺氧和1 h复氧处理;MPC组细胞于H/R损伤前用含1μmol/L吗啡的培养液孵育10 min,然后用不含吗啡的培养液正常培养30min;MPC+GW4869组细胞于H/R损伤前用5μmol/L外泌体释放抑制剂GW4869处理12 h,随后进行MPC;H/R+DMSO组细胞于H/R损伤前用5μmol/L DMSO处理12 h;H/R+GW4869组于H/R损伤前用5μmol/L GW4869处理12 h。各组处理结束后,采用CCK-8法检测细胞活力;微量酶标法测定培养液中乳酸脱氢酶(lactic acid dehydrogenase,LDH)的活性;流式细胞术检测细胞凋亡。4.MPC-Exo对H9c2心肌细胞H/R损伤的作用H9c2心肌细胞随机分为对照组(Control)、缺氧复氧组(H/R)、H/R+CON-Exo组、H/R+MPC-Exo组。Control组细胞置于DMEM/F12细胞培养液中常规培养;H/R组细胞给予5 h缺氧和1 h复氧处理;H/R+CON-Exo组和H/R+MPC-Exo组心肌细胞在H/R损伤前分别与CON-Exo或MPC-Exo共孵育12 h。各组处理结束后,采用CCK-8法检测心肌细胞活力;微量酶标法测定培养液中LDH的活性;流式细胞术检测细胞凋亡;q RT-PCR检测心肌细胞内以及外泌体内mi R-133b-5p的表达。结果1.外泌体的提取与鉴定大鼠血清的外泌体提取物在电镜下观察,呈圆形囊泡,平均直径约30-150 nm;Western blot结果显示其表达特异性标志蛋白CD63、热休克蛋白-60(heat shock proterin-60,HSP60)。2.外泌体的标记与摄取荧光显微镜下可见大量红色颗粒样物质在胞质中聚集,提示外泌体能被H9c2心肌细胞摄取。3.外泌体在MPC减轻心肌细胞H/R损伤中的作用与H/R组比较,MPC能显著减轻心肌细胞H/R损伤,增强细胞活力、减少LDH释放、抑制心肌细胞凋亡(P<0.05);与MPC组比较,MPC+GW4869组心肌细胞活力降低,LDH释放增加,细胞凋亡增多(P<0.05),MPC的保护作用被GW4869阻断。4.MPC-Exo对H9c2心肌细胞H/R损伤的作用MPC-Exo与H9c2心肌细胞共孵育,可以显著减轻心肌细胞H/R损伤,增强心肌细胞活力、减少LDH释放、并抑制心肌细胞凋亡,且显著上调心肌细胞内mi R-133b-5p的水平(P<0.05);相反,CON-Exo与心肌细胞共孵育后,对H/R损伤及mi R-133b-5p的表达无明显影响(P>0.05);与CON-Exo相比,MPC-Exo内mi R-133b-5p的表达水平明显升高(P<0.05)。结论MPC减轻心肌细胞H/R损伤依赖于外泌体释放,外泌体参与介导了MPC的心肌保护作用;MPC诱导释放的大鼠血清外泌体可以减轻心肌细胞H/R损伤,发挥心肌保护作用,其机制可能是介导心肌保护性的mi R-133b-5p转运。