论文部分内容阅读
背景:乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)引起的一种传染病,是引起急慢性肝炎的重要原因。目前全球慢性HBV感染者已达2.48亿,每年约有68.6万人死于HBV感染所导致的各种肝脏疾病。在我国,随着乙肝疫苗的普及,在1-4岁的人群中,乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)的携带率已经不到1.0%。但是目前HBV感染慢性化的具体机制仍不清楚。既往研究表明,当病毒感染机体时,其本身不具有细胞毒作用,机体所产生的免疫反应是致病的主要因素。单核-巨噬细胞既是固有免疫系统的主要成分,又发挥着启动和维持适应性免疫反应的主要作用。已有证据发现,慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者体内单核细胞功能受损,造成机体非特异性防御屏障受阻,影响病毒清除。而适应性免疫应答中,T细胞的耗竭在HBV致病过程中发挥着不可替代的作用。其中,单核-巨噬细胞对于T细胞功能的影响是造成T细胞功能受损的重要原因之一。研究发现肝脏巨噬细胞,即枯否细胞可以被乙型肝炎核心蛋白(hepatitis B core,HBc)激活,并上调Toll样受体2(toll like receptor 2,TLR2)的表达水平,进一步促进白细胞介素10(interleukin-10,IL-10)的分泌,促使T细胞耗竭,造成免疫耐受。在慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C,CHC)及获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)患者中研究发现,单核-巨噬细胞程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1,PD-1)表达较健康人升高,且它的升高抑制机体抗病毒作用。同时,CHC患者枯否细胞表达IL-18和干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)均升高,介导辅助性Ⅰ型T淋巴细胞(T helper cell,Th1)免疫反应,促进肝脏炎症和肝损伤的发生。我们的前期研究发现HBc变异表位肽S130P影响CD8~+T细胞分泌IFN-γ,并且病毒基因组突变的患者更易发生e抗原血清学转换。既往研究已知单核巨噬细胞可通过多种途径影响T细胞的功能,因此本课题拟探讨HBc变异表位肽S130P是否通过影响巨噬细胞免疫功能,进一步调节T细胞免疫活性,从而影响适应性免疫应答。故本研究利用HBc变异表位肽S130P刺激THP-1源性巨噬细胞、人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)及外周血单核细胞来源的巨噬细胞,利用流式细胞术和实时定量PCR的方法检测细胞TLR2、PD-1、IL-10及IL-18的表达水平,进一步探讨乙型肝炎慢性化的机制,为抗HBV治疗提供新的治疗靶点。目的:利用HBc S130P突变肽和未突变肽分别刺激THP-1源性巨噬细胞、PBMC及外周血单核细胞来源的巨噬细胞,观察单核-巨噬细胞TLR2、PD-1、IL-10及IL-18的表达情况,探讨它们在慢性乙型肝炎发病中的作用。方法:1.佛波酯(phorbol ester,PMA)诱导THP-1细胞为巨噬细胞,给予HBc S130P突变肽和未突变肽刺激,分别用流式细胞术和实时定量PCR检测细胞TLR2、PD-1、IL-10及IL-18的表达;2.收集2017年1月-2018年1月期间,就诊于本院感染病科门诊及住院部的初治CHB患者15例、乙型肝炎病毒无症状携带者(asymptomatic carriers,AsC)20例,并选取10例健康对照(health control,HC)作为对照组,收集一般资料及相关临床资料,分离PBMC,给予HBc S130P突变肽和未突变肽刺激,流式细胞术检测单核细胞TLR2、PD-1、IL-10及IL-18的表达;免疫磁珠法分离CHB组患者外周血单核细胞,人巨噬细胞集落刺激因子(human macrophage colony stimulating factor,M-CSF)将其诱导为巨噬细胞,给予多肽刺激,实时定量PCR检测巨噬细胞TLR2、PD-1、IL-10及IL-18的表达。结果:1.HBc变异表位肽刺激THP-1源性巨噬细胞,促进其表达TLR2、PD-1、IL-10及IL-18;2.HBc变异表位肽刺激人外周血单核细胞后,AsC组和CHB组患者单核细胞表达TLR2、PD-1、IL-10及IL-18均上升,但HC组仅TLR2表达升高;而多肽刺激外周血单核细胞源性巨噬细胞后,TLR2、PD-1、IL-10表达升高,IL-18表达无明显变化。结论:HBc变异表位肽S130P影响单核-巨噬细胞TLR2、PD-1、IL-10及IL-18的表达水平,提示HBV可能通过与单核-巨噬细胞相互作用,影响TLR信号转导通路以及细胞因子的分泌,调节机体免疫反应,从而影响HBV病程。