研究背景：衰老是心血管疾病发生的一个重要的危险因素，衰老过程中伴随着各种血管疾病的发生。衰老引起的血管改变包括动脉粥样硬化斑块的形成及血管反应性的改变，而血管反应性改变的机制很复杂，部分原因与离子通道的改变有关。有研究表明随着年龄增长，BKCa表达减弱，NO合成减少，从而影响血管舒缩功能的调节和正常血流动力学的维持，使血管收缩性增加。血管平滑肌主要表达四种类型钾通道，包括电压依赖性钾通道(Kv)，钙激活钾通道(KCa)，内向整流钾通道(Kir)和ATP敏感性钾通道(KATP)。钾通道对调节兴奋细胞的静息电位，从而维持血管平滑肌张力有重要意义。许多药物的舒血管作用与钾通道有关。我们前期研究证实，牛磺酸对正常大鼠主动脉的舒血管作用与四乙胺敏感钾通道有关，牛磺酸对胰岛素抵抗大鼠的缩血管作用也和钾通道有关。一些扩血管药物如尼可地尔，克罗卡林，吡那地尔和二氮嗪等可直接激活钾通道舒张血管，而一些特异性的钾通道阻断剂如4—氨基吡啶可通过抑制Kv通道的活性收缩血管。在目前已知的血管平滑肌钾通道中，Kv通道是表达最多，种类最丰富的离子通道。由于血管部位及同一部位血管分支的不同，Kv通道的生物学活性也不同。Kv在控制静息膜电位和小动脉直径方面起重要作用，因此分析正常情况下血管特异Kv通道的表达及功能非常重要，同样如果Kv通道的表达及功能发生变化将会导致各种疾病。目前研究仅局限于对Kv通道电流的宏观研究，然而不同部位血管平滑肌发挥作用的Kv通道具体亚型的研究还不清楚。利用RT-PCR和Westernblot方法已经发现Kv1.2和Kv1.5在大鼠脑动脉，肠系膜动脉，肺动脉均有表达，这些资料表明Kv1通道，特别是Kv1.2和Kv1.5在介导血管舒缩功能方面起重要作用。 研究表明，随年龄增加，大鼠主动脉VSM上的KCa通道表达增加，膜片钳实验证实KCa通道电流相应增加，离体实验证实动脉环对KCa通道抑制剂的收缩反应增强；而Kv通道则随年龄增加无明显变化。有研究表明，在老年大鼠，脑动脉和肺动脉KCa的表达无变化，冠状动脉则表达减少，对KCa通道抑制剂的收缩反应减弱。这说明衰老对不同部位BKCa通道的影响不一样。血管平滑肌表达多种钾通道，那么衰老对其他钾通道如Kv通道是否有影响目前报道很少。因此找出参与血管衰老的离子通道并阐明其作用机理非常重要。这将有助于我们理解血管衰老的进程，对减缓血管衰老，提高生存质量，降低老年人心血管疾病的发生有重要意义。 研究目的： (1)在观察钾通道阻断剂对青年大鼠不同部位小动脉收缩作用的基础上，探讨衰老对钾通道阻断剂在不同部位小动脉的作用的影响。 (2)在钾通道阻断剂对青年大鼠和老年大鼠小动脉的作用有差异的基础上，进一步探讨Kv通道功能变化和Kv1.2和Kv1.5基因表达的关系，从而为研究老年人心血管疾病的发生提供实验依据。 本实验中钾通道阻断剂选用了四乙胺(Tetraethtylamine，TEA)，格列本脲(Glibenc lamide，Gli)，4—氨基吡啶(4—aminopyridine，4—AP)和氯化钡(BaCl2)。小动脉标本我们选用了肺动脉、冠状动脉、大脑中动脉、肾动脉和肠系膜动脉。 研究方法： 1．离体微血管环实验方法。 大鼠脱臼处死后，立即取出肠系膜、肾脏、心脏、肺组织和大脑，浸入4℃的PSS液中。肠系膜及肾动脉环的制备：将取出的肠系膜和肾脏组织浸入含有4℃PSS液的平皿，用大头针固定动脉主干和周围组织，分离去除动脉周围的脂肪组织，选取动脉的三级分支血管，剪取2mm左右的血管环。大脑中动脉环的制备：钝性分离大脑中动脉，在靠近内侧处剪取2mm左右的血管环。冠状动脉血管环的制备：钝性分离冠状动脉，在前降支处剪取2mm的血管环。肺动脉环的制备：用镊子轻轻剥离肺组织，找到与肺内支气管并行的小血管即为肺动脉。沿肺动脉剥离其二级分支血管，剪取2mm左右的血管环。将两根直径为40μm的钢丝穿入管腔，固定血管环在Multi Myograph System-610M浴槽内传感器上。浴槽内含有5mlPSS，持续通以100％O2，温度控制在37℃，平衡60min后开始实验。平衡期间每隔15min用预热(37℃)的新鲜PSS液更换浴槽内液体一次。血管环的张力变化通过DMT的换能系统采集，并用Chart5.4生物信号分析处理软件记录在微机上。为了使血管环处于最佳反应状态，分别调整肠系膜动脉、肾动脉、大脑中动脉、冠状动脉、肺动脉的跨壁压，使其分别保持在相当于100mmHg、80mmHg、80mmHg、80mmHg和80mmHg的基础压力状态。为了检测血管环在离体状态下对血管活性物质的反应性，在开始正式实验之前，用80mmol/L的KCl预收缩，当相邻两次刺激的收缩幅度差别不大于10％时，开始正式实验。制作BaCl2(10-5，3×10-5，10-4，3×10-4，10-3，3×10-3和10-2mol/L)，4—AP(10-3，3×10-5，10-4，3×10-4，10-3，3×10-3和10-2mol/L)，Gli(10-5，3×10-5，10-4，3×10-4，10-3，3×10-3和10-2mol/L)和TEA(10-5，3×10-5，10-4，3×10-4，10-3，3×10-3，10-2和3×10-2mol/L)的浓度依赖性曲线。以80mmol/LKCl的收缩幅度为100％，计算药物各浓度的收缩率。 2．RT-PCR实验方法。 青年大鼠或老年大鼠脱臼处死后，立即取出肠系膜、肾脏、心脏、肺组织和大脑，浸入4℃的PSS溶液中。常规方法分离肠系膜动脉、冠状动脉、肾动脉、大脑中动脉和肺动脉，将分离得到的动脉组织放入液氮中保存。根据UNlQ-10柱式总RNA抽提试剂盒提供的说明书提取总RNA。用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的无菌水溶解RNA，并将RNA放到-70℃保存。用OD值测定RNA的纯度，以OD260/OD280＞1.7认为RNA纯度较好。然后根据TakaRa RNA PCRKit(AMV)Vet．3.0提供的方法进行RT-PCR分析，实验用的引物有内参基因GAPDH，目的基因Kv1.2和Kv1.5。首先进行逆转录反应，提取得到的cDNA样品用于PCR反应。PCR反应条件为GAPDH29个循环，Kv1.2共30个循环，Kv1.5共35个循环。扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳(含0.5μg/ml溴化乙锭)，用天能凝胶成像系统观察结果并扫描保存，进行PCR条带灰度扫描，以GAPDH作为内参，作半定量分析。 结论： 1. 与青年大鼠相比，老年大鼠大脑中动脉Kv通道阻断剂对其收缩作用和Kv通道mRNA表达均有改变，老年大鼠Kv通道阻断剂对大脑中动脉收缩作用减弱，而Kv1.2和Kv1.5的mRNA表达却增强。 2. 除TEA对老年大鼠冠状动脉收缩作用明显低于青年大鼠之外，TEA对老年大鼠和青年大鼠其余四种小动脉和BaCl2对五种小动脉的收缩作用均无显著性差异，也就是说衰老对BaCl2在大鼠五种小动脉上的作用无影响。