草鱼重复基因IGF-2的克隆及其功能研究

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草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国重要的经济鱼类,养殖产量在淡水鱼类中名列前茅。草鱼个体较大,性成熟周期长,采用传统方法很难在短期内培育出优良品种。草鱼基因组中存在着大量的未知功能主效基因、非编码RNA和DNA调控元件。解读这些组分的功能对于认识草鱼生殖、生长、发育及抗逆等性状具有重要的理论意义和应用价值。   IGF-2是胰岛素样生长因子家族的重要成员,它受到生长激素的调控,能促进细胞的有丝分裂和分化,与鱼类胚胎发育和成体生长紧密相关。在哺乳动物仅中存在一个IGF-2基因,而斑马鱼中却存在两个重复的IGF-2基因,即igf-2a和igf-2b,且研究表明斑马鱼igf-2a和igf-2b出现了明显的功能分化。由于在其他硬骨鱼类中尚未发现存在igf-2b基因的报道,因此不能确定重复IGF-2基因是否与鱼类特有的第3次全基因组重复相关:此外,重复IGF-2基因的促生长功能差异也有待探讨。   本文通过RACE方法,首次获得了养殖鱼类草鱼IGF-2a/b重复基因cDNA的全长序列,IGF-2a和IGF-2b基因全长分别为2076bp和1692bp,开放阅读框分别为603bp和692bp,编码201和212个氨基酸残基。这为草鱼和斑马鱼中的IGF-2a和IGF-2b基因是由鱼类特有的第三次全基因组复制所产生的提供了新的依据。与人IGF一样,草鱼IGF-2a和IGF,2b成熟肽均由B、C、A、D四个结构域组成,其中所有6个半光氨酸完全保守。不同胚胎时期RT-PCR分析结果表明,草鱼IGF-2a和IGF-2b基因在整个胚胎发育过程中都有表达,且表达量均比较恒定,表达量差异不明显。整胚原位杂交结果显示,IGF-2b mRNA在草鱼胚胎中存在广泛表达,而IGF-2a则仅在脊索和脑中表达。在成年草鱼中,IGF-2b在除鳃之外的所有组织中表达,而IGF-2a则主要在肝脏中表达。这表明草鱼IGF-2b可能保留了IGF-2的原始功能,在成年草鱼的代谢过程中行使1GF-2的主要功能。而IGF-2a则在进化过程中发生了亚功能化,并失去了祖基因的大部分功能。生长激素可诱导草鱼肝细胞中的IGF-2a和-2b转录本水平快速上调。此外,营养水平也会影响草鱼IGF-2a和IGF-2b的转录水平,肝脏中IGF-2a和IGF-2b mRNAs的表达量在2到6天的饥饿过程中明显下降,在恢复喂食后迅速回复。通过构建重组表达载体pGEX-KG-IGF-2进行了IGF-2a的原核表达研究,确定IGF-2a蛋白的最佳诱导表达条件为30℃0.1mM IPTG诱导表达3hrs。上述研究结果表明,草鱼IGF-2重复基因功能即保守而又存在明显差异,它们在草鱼的胚胎发育和成体生长过程中起着重要作用。
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