研究背景健康人群的肠道内寄居着种类繁多的微生物,构成人体肠道内复杂而庞大的微生态系统,因这些微生物98%以上为细菌,所以统称为肠道菌群。种类不同的肠道菌群按一定比例形成生理组合,且各菌间互相拮抗、互相协同,最终在质和量上形成一种动态平衡,组成了人体肠黏膜屏障中的生物屏障部分。肠道菌群可以看作机体的一个细菌器官,在机体的消化营养、生物合成、生物屏障及免疫系统成熟等方面都发挥着重要的作用,对宿主维持机体健康是必需和有益的。生理情况下,肠道常驻菌群与完整的肠黏膜结构、黏膜表面的粘蛋白、分泌型免疫球蛋白A(sIgA)、及肠壁免疫细胞共同构成了肠道的黏膜屏障系统,阻止了肠道细菌及细菌产生的内毒素向肠外易位。一旦肠道微生物群的组成、分布和数量发生改变而超出自身调节能力即出现肠道微生态失衡,可引起肠道乃至全身的一系列病理生理改变,导致诸多疾病的发生。长期使用广谱抗生素、抗肿瘤、免疫抑制剂等药物以及慢性疾病、重大手术、营养不良等状态下均可出现肠道微生态失衡,近年来大量研究发现,肠道微生态失衡与炎症性肠病、肠易激综合征、抗生素相关性肠炎、慢性肝病、肥胖、糖尿病、冠心病甚至精神和行为异常等疾病密切相关；而在应激和免疫低下状态,肠道微生态失衡甚至能导致严重的肠屏障功能衰竭,进而引发系统性炎症反应综合征(SIRS)和多器官功能衰竭(MOF),后者几乎是所有临床学科都面临着的致死性症候群。慢性肾脏病的防治已经成为世界各国面临的一个重要的公共健康问题。根据国际肾脏病学会统计,自然人群年发病率约为98-198/百万人口,我国近年统计资料显示,慢性肾脏疾病的年发病率约为2-3%o,尿毒症的年发病率为约100-130／百万人口,且有逐年上升的趋势,成为影响国民健康的主要疾病。近20年来,在人类主要死亡原因中尿毒症占第五位至第九位,是人类生存的重要威胁之一。如何延缓慢性肾脏病进程、改善患者生活质量、延长患者生存期是慢性肾脏病防治的重要课题。研究证实,慢性肾功能衰竭患者体内普遍存在慢性微炎症状态,微炎症状态是以单核巨噬细胞系统激活,IL-1p、IL-6、TNF-a为主的促炎因子释放为中心的慢性全身性的炎症状态,表现为全身循环中炎性因子的持续低度升高,常常不伴有临床症状。微炎症状态与慢性肾功能衰竭患者的诸多并发症密切相关,参与慢性肾脏病的恶性发展,是影响慢性肾脏病预后的独立危险因素。因此探究如何改善这种炎症状态是延缓慢性肾衰进程的重要途径。肠道作为机体最大的储菌库和内毒素池,在炎症反应中发挥着至关重要的作用,那么在慢性肾功能衰竭过程中肠道究竟扮演着怎样的角色?肠道菌群及其代谢产物是否参与了微炎症反应的过程乃至肾功能衰竭的进展?这些问题都亟待解答。研究表明胃肠道是慢性肾功能衰竭患者最易受累的器官之一,具体表现在：①胃肠黏膜的炎症、萎缩、水肿、化生和消化性溃疡等肠黏膜屏障受损的表现；②胃排空延迟,肠蠕动减慢；③尿毒症毒素多来源于肠道细菌腐败作用产生的肠源性毒素；④肠道局部免疫功能下降。此外,慢性肾功能衰竭患者易出现代谢性酸中毒,也可导致肠黏膜屏障的通透性增高,肠道菌群发生易位。Magnusson等通过测定尿中聚乙二醇(PEGs)发现慢性肾功能衰竭患者肠道通透性增加。de Almeida通过对尿毒症及正常小鼠肠黏膜炎症评分、肝脾及肠系膜淋巴结离体培养,发现罹患尿毒症的小鼠肠黏膜屏障有损伤且发生了细菌易位。以上研究提示肠黏膜屏障功能损伤及肠道菌群结构改变可能参与了慢性肾功能衰竭的进展。本研究即是为了证实这一推测而进行的。本研究中,我们通过检测血液中内毒素及细菌DNA含量研究了慢性肾功能衰竭患者中细菌易位的情况,并利用细菌培养、实时荧光定量PCR及宏基因组学手段,从微观的特定菌种生长情况到宏观的微生态群落整体结构等不同侧面,对慢性肾功能衰竭过程中肠道菌群变化进行了研究,为了解肠道菌群在慢性肾功能衰竭发展过程中的作用提供了参考。材料与方法1、纳入研究对象依据K/DOQI慢性肾脏病(CKD)的标准选择纳入对象,以健康志愿者作为正常对照,共计纳入92位慢性肾功能衰竭患者和96位健康对照者。伴有腹泻或其它肠道疾病,采样前4周内使用过抗生素、益生菌／益生元以及尿毒清等含导泻成分的制剂作为排除标准。2、血清内毒素、细菌DNA、CRP及其它生化指标检测所有研究对象取外周静脉血标本2-5mL,收集在无热原的促凝采血管中,平衡后室温下离心分装。采用显色基质鲎试剂盒(厦门鲎试剂厂)测定血清内毒素含量。细菌DNA采用实时荧光定量PCR方法(详见后述)。血清CRP及其它生化指标测定由南方医院检验科协助完成。3、粪便细菌培养接种于肠杆菌、肠球菌、拟杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌及梭菌的选择性培养基上。兼性厌氧菌置于37°C普通培养箱培养48h,厌氧菌置于厌氧培养箱中培养72h。结果以每克湿粪的菌落形成单位(colony forming unit,CFU)的对数值表示。4、细菌实时荧光定量PCR检测反应体系为20μ1：SYBR Green Master Mix 10μl,上下游引物各1μ1,模板DNA5μl, ddH2O3μl;反应条件：95℃预变性5min；95℃变性10s、退火20s、72°C延伸30s,共45个循环；反应完毕后进行熔解曲线分析,判断产物特异性。5、高通量测序及生物信息学分析采用带barcode(标准化条码)的通用引物针对细菌16S rRNA V46区域进行PCR扩增,扩增体系为20μ1,其中上下游引物各0.5μ1,模版1μ1,Premix Taq酶10μ1,双蒸水8μ1。反应条件为：94°C预变性2 min,94°C变性30s,59°C退火30s,72°C延伸30s,共25个循环,之后72°C延伸5min。PCR产物交由华大基因进行Illumina测序。所测序列采用BIPES (barcoded Illumina paired-end sequencing)流程进行处理,经BIPES处理得到的干净序列通过TSC(Two-Stage-Clustering)算法聚类为操作分类单元(Operational-Taxonomic-Units, OTUs),采用RDP (Ribosomal Database Project)建立操作分类单元的系统发育树,根据UniFrac距离对序列进行主坐标分析(Principal coordinate analysis, PCoA),并通过线性判别分析(the linear discriminant analysis, LDA)和LEfSe方法对差异菌属进行识别。6、统计学分析本实验所有数据均采用SPSS13.0统计软件进行分析,服从正态分布的计量资料以均数±标准差的形式进行表述,不服从正态分布的计量资料用中位数与四分位间距的形式进行表述,计数资料以率表示。统计分析过程中正态分布资料比较组间差异采用One-Way ANOVA单向方差分析,非正态分布资料采用非参数检验,比较组间差异采用了两独立样本非参数检验中的Mann-Whitney U检验以及多个独立样本非参数检验中的Kruskal-Wallis H检验,率的比较采用χ2检验,相关性分析采用Spearman秩相关检验。双侧P<0.05表示差异具有统计学意义。研究结果1、研究对象基本特征征询了199位慢性肾功能衰竭患者和203位健康对照者,最终有92位慢性肾功能衰竭患者和96位健康对照者完成样本采集。肾小球滤过率<15ml/min/1.73m2的患者定义为终末期肾病患者,其余患者为非终末期患者。非终末期肾病、终末期肾病与健康对照三组对象的体重(x2=1.625,P=0.444)、极低密度脂蛋白(x2-4.177,P=0.124)、低密度脂蛋白(x20.966,P=0.617)、高密度脂蛋白(2=1.708,P=0.426)、甘油三酯(2=1.067,P=0.586)、总胆固醇(χ2=0.776,P=0.678)及血糖水平(x2==2.401,P=0.301),均无统计学差异。2、血清内毒素、细菌DNA、CRP检测非终末期肾病、终末期肾病与健康对照三组间内毒素水平(χ2=8.357,P=0.015)、细菌DNA含量(χ2=20.796,P=0.000)有统计学差异,非终期肾病组内毒素水平(Z=-2.653,P=0.008)、细菌DNA含量(Z=-3.674,P=0.000)较健康对照显著升高,终末期肾病组内毒素水平(Z=-2.522,P=0.012)、细菌DNA含量(Z=-4.178,P=0.000)也较健康对照显著升高,但非终末期肾病与终末期肾病组之间无统计学差异(内毒素Z=-0.335,P=0.737；细菌DNA含量Z=-1.698,P=0.090)。三组间CRP水平有统计学差异(χ2=22.435,P=0.000),终末期肾病组较健康对照组显著升高(Z=-4.446,P=0.000),且终末期肾病组较非终末期肾病组显著升高(Z=-3.337,P=0.001),非终期肾病组与健康对照组无统计学差异(Z=-0.815,P=0.415)。3、传统细菌培养统计能够培养出细菌的样本数目,肠杆菌与肠球菌作为兼性厌氧菌,培养出的概率较厌氧菌拟杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、梭菌高,依次为肠杆菌90.26%,肠球菌85.71%,拟杆菌49.35%,双歧杆菌37.66%,乳酸杆菌25.97%,梭菌20.13%。慢性肾病组较健康对照组的肠杆菌(X2=8.888,P=0.003)、肠球菌(χ2=15.383,P=0.000)培养阳性率显著降低,拟杆菌(x2=0.701,P=0.402)、双歧杆菌(x2=0.922,P=0.337)、乳酸杆菌(x2=0.180,P=0.671)、梭菌(X2=2.275,P=0.131)的培养阳性率无统计学差异。非终末期肾病组、终末期肾病组与健康对照三组肠杆菌(χ2=8.117,P=0.017)、肠球菌(χ2=23.898,P=0.000)菌落数有统计学差异,其中非终末期肾病组与健康对照的肠杆菌(Z=-0.818,P=0.413)、肠球菌(Z=-1.592,P=0.111)数量无统计学差异,终末期肾病组肠杆菌(Z=-2.846,P=0.004)、肠球菌(Z=-4.991,P=0.000)较健康对照显著减少。三组间拟杆菌(妒=4.634,P=0.099)、双歧杆菌(x2=0.915,P=0.633)、乳酸杆菌(χ2=0.753,P=0.686)、梭菌(χ2=2.157,P=0.340)菌落数无统计学差异。4、细菌实时荧光定量PCR非终末期肾病组、终末期肾病组与健康对照三组间细菌总量(χ2=70.674,P=0.000)、肠杆菌(χ2=8.425,P=0.015)、肠球菌(χ2=23.643,P=0.000)、拟杆菌(χ2=27.548,P=0.000)、双歧杆菌(x2=47.544,P=0.000)、梭菌(x22=8.454,P=0.015)基因拷贝数均有统计学差异,而三组间乳酸杆菌基因拷贝数(x2=1.798,P=0.407)无统计学差异。在非终末期慢性肾病患者中,细菌总量(Z=-5.402,P=0.000)、肠球菌(Z=-3.984,P=0.000)、拟杆菌(Z=-2.769,P=0.006)、双歧杆菌(Z=-4.606,P=0.000)数量较健康对照组均显著降低；梭菌(Z=-0.383,P=0.702)略有降低但差异无统计学意义；肠杆菌(Z=-0.775,P=0.438)、乳酸杆菌(Z=-0.417,P=0.677)有所升高,但同样无统计学差异,在终末期慢性肾病患者中,细菌总量(Z=-7.659,P=0.000)、肠杆菌(Z=-2.535,P=0.011)、肠球菌(Z=-3.898,P=0.000)、拟杆菌(Z=-5.100,P=0.000)、双歧杆菌(Z=-6.308,P=0.000)、梭菌(Z=-2.851,P=0.004)数量较健康对照组均显著降低；乳酸杆菌(Z=-0.987,P=0.324)数量差异无统计学意义。CRP水平升高的个体较CRP水平正常的个体,肠道细菌总量显著减少,差异有统计学意义(Z=-3.035,P=0.002)。5、高通量测序及生物信息学分析主坐标分析显示无论非终末期肾病患者还是终末期肾病患者肠道菌群结构都与健康对照组有差异,终末期肾病组差异更显著。慢性肾功能衰竭患者与健康对照组肠道细菌主要集中在以下9个门类：拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)、放线菌门(Actinobacteria),和只占极少比例的疣微菌门(Verrucomicrobia)、互养菌门(Synergistetes)、黏胶球形菌门(Lentisphaerae)、蓝细菌门(Cyanobacteria),其中以拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和放线菌门为主。无论在慢性肾功能衰竭患者还是健康对照中,拟杆菌门和厚壁菌门都是最丰富的两大门类。线性判别分析提示与健康对照组相比,以下细菌在非终末期肾病患者中显著减少,分别为隶属于拟杆菌门的普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、Paraprevotella和Butyricimonas,隶属于厚壁菌门的瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、小类杆菌属(Dialister)、梭菌科(Clostridiaceae)、 Catenibacterium、罗氏菌属(Roseburia)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、真杆菌属(Eubacterium)、粪球菌属(Coprococcus)和Dorea,以及隶属于放线菌门的柯林斯菌属(Collinsella);以下细菌在终末期肾病患者中显著减少,分别为隶属于拟杆菌门的普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、普雷沃氏菌属(Prevotella)和霍氏菌属(Hallella),隶属于厚壁菌门的罗氏菌属(Roseburia)、柔嫩梭菌属(Faecalibacterium)、小类杆菌属(Dialister)、粪球菌属(Coprococcus)、Dorea、 Catenibacterium、Butyricicoccus和Oribacterium,以及隶属于变形菌门的假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、假单孢菌属(Pseudomonas)、巴斯德氏菌目(Pasteurellales)、巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、Parasutterella和Alcallgenaceae。无论在非终末期肾病患者还是终末期肾病患者中,拟杆菌门(Bacteroidetes)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、拟杆菌属(Bacteroides)的数量均较健康对照组多。结论1、肠道菌群失衡普遍存在于慢性肾功能衰竭患者中,这种肠道菌群失衡表现为低丰度细菌类群最先受到影响,并且对肠道健康有益的丁酸盐产生菌数量明显减少,肾功能障碍程度越高,肠道菌群的结构失衡越严重。2、慢性肾功能衰竭患者存在肠黏膜屏障的损伤,主要表现为肠黏膜通透性增加,由此引发的细菌易位及肠源性内毒素血症,可能是慢性肾功能衰竭患者体内存在微炎症状态的重要原因。3、宏基因组学分析能从宏观角度探索微生态环境的改变,但费用高昂,目前仅适用于科学研究；传统细菌培养能够在一定程度上提示肠道菌群失衡,成本低廉,且能进一步进行活菌分析,仍具有临床使用价值。