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目的:脂肪细胞是人和动物重要的能量储存和内分泌调控细胞,GATA2/3在脂肪细胞形成中发挥重要调控作用;本课题组前期研究显示C/EBPZ可能与GATA2/3启动子结合调控GATA2/3的转录。目前,C/EBPZ在脂肪组织中的功能及其转录调控机制尚不清楚,本研究目的是:利用生物信息学和细胞分子生物学方法探索C/EBPZ在脂肪组织中的功能及其表达的转录调控机制。方法:1.生物信息学分析:采用人蛋白图谱（HPA）数据库信息结合统计学方法研究C/EBPZ在人脂肪组织中的表达模式。2.细胞生物学实验:利用p CMV-HA和p CMV-HA-C/EBPZ质粒转染鸡前脂肪细胞使C/EBPZ在鸡前脂肪细胞中过表达,实验分为EV组（转染p CMV-HA质粒）和C/EBPZ过表达组（转染p CMVHA-C/EBPZ质粒）。采用100μM油酸诱导前脂肪细胞分化48 h后,利用油红O染色观察脂肪细胞的分化情况;利用Cell Tite Glo（?）发光法细胞活力检测方法测定前脂肪细胞的增殖能力,采用流式细胞术检测前脂肪细胞的细胞周期;荧光素酶报告基因技术研究过表达C/EBPZ对脂肪细胞重要功能基因PPARγ、GATA2、GATA3、LPL、FASN、C/EBPα和FABP4启动子活性的影响、C/EBPZ基因5’侧翼区启动子活性、以及过表达KLF2对C/EBPZ启动子活性的影响。3.分子生物学实验:RNA-seq技术结合生物信息学技术研究过表达C/EBPZ对前脂肪细胞转录组表达模式的变化;Western blot检测分析在前脂肪细胞中C/EBPZ、PPARγ和KLF2的表达变化;利用Real-time PCR研究过表达C/EBPZ在鸡脂肪细胞中对脂肪细胞重要功能基因转录的作用;利用分子克隆技术获得鸡C/EBPZ转录起始位点上游2031bp的序列,并利用截短突变技术对其进行启动子序列分析;用DNA pull down技术分析鸡C/EBPZ启动子179 bp长度序列,采用荧光素酶报告基因技术、表达分析、定点突变和Ch IP-PCR技术研究KLF2调控C/EBPZ表达的作用机制。结果:1.C/EBPZ在脂肪组织中的表达模式C/EBPZ在人脂肪组织中表达,并且随着脂肪细胞的增加,脂肪组织中C/EBPZ的表达水平下调（P＜0.05）,在代谢旺盛的腹部脂肪组织中C/EBPZ的表达水平显著低于相对稳定的皮下脂肪组织（P＜0.05）,随着年龄的增加,成人脂肪组织中的C/EBPZ表达水平显著上调（P＜0.05）。2.C/EBPZ调控鸡前脂肪细胞增殖和分化RNA-seq结果显示:与对照组相比,过表达C/EBPZ的鸡前脂肪细胞中有448个基因上调,354个基因下调。基因富集分析（GSEA）显示,C/EBPZ可能参与感染疾病的病理过程（GO:0019048/GO:0044003）和脂肪组织发育（GO:0060612）的调控。Real-time PCR分析显示C/EBPZ在鸡前脂肪细胞中表达,并且随着油酸诱导的鸡前脂肪细胞分化C/EBPZ的表达下调（P＜0.05）。细胞增殖实验表明过表达C/EBPZ促进鸡前脂肪细胞增殖。流式细胞周期实验分析显示,与对照组相比,过表达C/EBPZ的鸡前脂肪细胞在G2期和S期细胞的比例没有显著差异（P＞0.05）,但G0期细胞比例显著低于EV组（P＜0.05）。此外,油红O染色分析显示,过表达C/EBPZ抑制油酸诱导的鸡前脂肪细胞分化（P＜0.05）。荧光素酶报告基因显示:过表达C/EBPZ显著抑制鸡PPARγ、C/EBPα、LPL和FASN的启动子活性（P＜0.05）,显著促进FABP4和GATA2启动子活性（P＜0.05）,对GATA3启动子活性也可能具有促进作用（P=0.07）。Real-time PCR和Western blot显示:过表达C/EBPZ显著抑制鸡前脂肪细胞中PPARγ的表达（P＜0.05）。3.鸡C/EBPZ表达的转录调控研究鸡C/EBPZ的5’侧翼序列（-2025 bp/+6 bp）有明显的启动子活性（P＜0.01）。将p GL4.10-C/EBPZ（-2025/+6）启动子报告基因质粒与GATA2、GATA3、KLF2和KLF3过表达质粒共转染,荧光素酶报告基因结果显示:与EV组相比,过表达KLF2显著促进鸡C/EBPZ（-2025/+6）启动子活性（P＜0.01）,过表达KLF3抑制鸡C/EBPZ（-2025/+6）启动子活性（P＜0.05）,过表达GATA2和GATA3对鸡C/EBPZ（-2025/+6）启动子活性没有显著影响（P＞0.05）,过表达C/EBPZ自身对C/EBPZ（-2025/+6）启动子活性没有显著影响（P＞0.05）。鸡C/EBPZ的5′侧翼区域的（-94 bp/+6 bp）、（-173 bp/+6 bp）、（-485 bp/+6 bp）、（-793bp/+6 bp）、（-1409 bp/+6 bp）和（-2025 bp/+6 bp）的荧光素酶报告基因显示:C/EBPZ所有长度启动子均有荧光素酶活性（P＜0.01）,（-94 bp/+6 bp）可能是调控C/EBPZ转录的核心启动子区。C/EBPZ启动子报告基因质粒与KLF2过表达质粒共转染鸡前脂肪细胞后的荧光素酶报告基因分析,结果显示:KLF2对C/EBPZ（-94/+6）启动子活性的促进作用最明显（P＜0.01）。不同质量浓度的KLF2过表达质粒与p GL4.10-C/EBPZ（-94/+6）启动子共转染,结果显示:随着p CMV-mycKLF2质粒质量的增加,C/EBPZ荧光素酶活性逐渐升高,存在明显的剂量效应（P＜0.001）。Realtime PCR和半定量PCR结果显示:KLF2上调C/EBPZ的m RNA表达（P＜0.01）。Western blot结果显示:过表达KLF2促进C/EBPZ的蛋白表达。Ch IP-PCR结果显示:KLF2与C/EBPZ启动子区存在多个核苷酸序列结合位点。将C/EBPZ（-94/+6）质粒序列进行点突变,与过表达KLF2的质粒共转染,荧光素酶报告基因结果显示:突变型p GL4.10-C/EBPZ（-94/+6）质粒活性低于野生型p GL4.10-C/EBPZ（-94/+6）质粒活性（P＜0.01）。DNA pull down结果共筛选出189个与鸡C/EBPZ启动子（-173 bp/+6 bp）序列结合的蛋白质,在COG数据库中对比出与C/EBPZ转录调控相关的因子有12个,通过在GO、KEGG数据库里比对分析发现这些蛋白质与核糖体结构生成、胞质大核糖体亚基、核仁、核糖体等方面相关;通过富集分析Reactome发现这些蛋白质主要与RNA代谢、类泛素化、泛素E3连接酶泛素化靶蛋白、外显子结复合体增强和无意义介导衰变等方面相关;Panther数据库富集分析发现这些蛋白质与P53和Wnt信号通路相关。结论:1.C/EBPZ是脂肪组织形成的重要调控因子,在体外细胞水平过表达C/EBPZ可以通过抑制PPARγ和C/EBPα等功能基因的表达,抑制脂肪细胞分化,促进脂肪细胞增殖。2.鸡C/EBPZ基因的翻译起始位点上游（-2025 bp/+6 bp）序列具有明显的启动子活性,其基础启动子可能在翻译起始位点上游（-94 bp/+6 bp）序列区间,KLF2可以作用于鸡C/EBPZ启动子序列上调C/EBPZ的表达,鸡C/EBPZ翻译起始位点上游（-173 bp/+6 bp）序列与核糖体蛋白结合,与蛋白质翻译有关。