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胃癌是常见的消化道恶性肿瘤,通过根治性手术,胃癌早期治愈率已超过90%。然而胃癌发病症状隐匿,多数患者就诊时往往已处于进展期或晚期,影响了该病的治愈率,术后的复发、侵袭和转移是预后差的重要因素。因此,寻找胃癌发展、侵袭、转移过程中的关键生物因子,对于进一步认识胃癌、治疗胃癌具有重要意义。激肽释放酶（Kallikrein,KLK）是一组丝氨酸蛋白酶,主要在前列腺、乳腺、卵巢、睾丸等产生类固醇激素的组织或激素依赖性组织中表达,通过串联酶解反应激发或终止生理或病理过程而发挥其生物学功能。KLK6是KLKs家族成员之一,近些年来,研究发现其在乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、结肠癌、食管癌、胃癌、胰腺癌等肿瘤组织中表达上调,可能参与了肿瘤的生长、侵袭及转移。新生血管的生成促进了肿瘤的增长。血管内皮生长因子（vaseular endothelial growth factor,VEGF）家族是一种功能强大且能产生多种生物学效应的生长因子,在体外能促进内皮细胞生长,在体内可诱导血管发生。目前已知其促血管生长作用最强,它通过调节细胞外基质,改变血管通透性,增加血管新生,从而促进了肿瘤细胞的迁徙转移。肿瘤血管密度（microvessel density,MVD）是判定血管生成的良好指标,反映了肿瘤血管生成的数量。基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase,MMP-9）属于MMPs家族,其主要作用是降解IV型胶原,导致肿瘤细胞突破正常血管和淋巴管基底膜,直接浸润进入血管和淋巴管,最终导致肿瘤的侵袭与转移。以上四种生物指标与肿瘤的增殖、生长、转移相关。目前KLK6在胃癌中的研究较少,对胃癌血管生成的作用及机制未见报道,其参与胃癌细胞发生、浸润、转移机制尚不明确。本课题拟从以下两个部分进行研究。首先收集胃癌和正常胃粘膜组织标本,检测KLK6、VEGF、MMP-9 mRNA和蛋白在胃癌组织中的表达情况,分析各指标的相关性、与胃癌的临床病理学及预后间的关系。进一步进行体外细胞培养实验,选择四株胃癌细胞和一株正常细胞系,检测各组细胞系中KLK6、VEGF、MMP-9的表达,通过体外实验了解KLK6对胃癌细胞生物学的影响,分析KLK6表达和血管生成的关系。第一部分:KLK6在胃癌组织中的表达、与血管生成及预后的关系方法1.通过免疫组化技术,对326例胃腺癌和相对应的正常胃粘膜组织进行KLK6、VEGF、MMP-9蛋白的表达的检测,MVD（微血管密度）以每高倍视野中的染CD34微血管的数量判定,然后再转换成定性资料,分析比较KLK6、VEGF、MMP-9蛋白的表达、MVD及其与胃癌临床病理学参数之间的关系;2.选取10例胃腺癌组织和相对应的正常胃粘膜组织,采用实时荧光定量qPCR实验及Western blotting实验检测随机KLK6、VEGF、MMP-9 mRNA和蛋白的表达,进一步验证免疫组化技术的实验结果;3.对326例胃癌患者进行完整随访,记录生存时间,对KLK6、VEGF、MMP-9的表达与胃癌预后进行统计处理,绘制生存曲线,了解其各指标与预后的关系。结果1.与正常胃粘膜相比,胃腺癌组织中KLK6 mRNA和蛋白表达量显著升高（P<0.05）。2.KLK6的高表达与胃癌患者淋巴结转移和TNM分期显著相关（P<0.05）。3.KLK6高表达的胃癌患者,其生存率显著降低,KLK6为胃癌患者的独立预后因子。4.相关性分析结果表明,KLK6、VEGF、MMP-9、MVD在胃腺癌组织中的表达具有显著的相关性（P<0.05）。KLK6可能促进了肿瘤血管形成和侵袭转移。第二部分:KLK6表达上调对胃癌细胞生物学行为的影响及机制探讨方法1.选择一株正常胃粘膜细胞和四株胃癌细胞,分别应用RT-PCR和Western blotting方法,检测各组细胞系中KLK6、VEGF、MMP-9 mRNA和蛋白的表达量,分析相关性。2.流式细胞仪分选出KLK6阳性胃癌细胞,MTT和平板克隆实验检测胃癌细胞增殖能力。Transwell实验、划痕愈合实验和粘附实验检测胃癌细胞的侵袭迁移能力。3.应用Western blotting方法,检测KLK6阳性胃癌细胞和KLK6阴性胃癌细胞中VEGF蛋白的表达量,分析其相关性。结果1.与正常胃粘膜相比,各胃癌细胞系中KLK6、VEGF、MMP-9 mRNA和蛋白的表达均升高,其中SGC7901胃癌细胞远高于其它三组（P<0.05）。2.KLK6高表达胃癌细胞增殖、粘附、侵袭转移能力显著增高。3.Western blotting结果显示,KLK6阳性胃癌细胞VEGF表达较KLK6阴性胃癌细胞明显增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论1.KLK6在胃癌组织及细胞中的高表达与VEGF、MMP-9表达相关;2.KLK6与胃癌细胞生长增殖能力和运动迁移及侵袭能力显著相关;3.KLK6高表达是胃癌患者的独立预后因素。