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为了研究AtCRN1同源基因BeCRN1的功能并建立金丝慈竹遗传转化体系,本实验选用金丝慈竹作为原材料,进行以下各项研究:采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术,在金丝慈竹叶片中分离得到BeCRN1;对Be CRN1进行生物信息学分析;植物双元表达载体pCHF3-BeCRN1构建与导入;采用组织化学法对金丝慈竹愈伤组织进行GUS基因瞬时表达检测金丝慈竹;愈伤组织的抗生素敏感性测试。结果表明:
(1)所获得的cDNA全长为1646bp,带一短poly(A)尾巴。该cDNA包含1473bp长的开放阅读框(ORF),编码一个含有491个氨基酸残基的多肽,含有长度45bp的5UTR和128bp 3UTR。
(2)NCBI BLAST序列分析表明,BeCRN1与水稻中的相关蛋白(EEC805 74.1)一致性和相似性最高,分别为414/487(85%)和446/487(91%)。与拟南芥中的CRN1蛋白(NP_196884.1)一致性为59%,相似性为75%。
(3)构建了植物双元表达载体pCHF3-BeCRN1,并采用冻融法导入农杆菌GV3101工程菌中,为以后验证BeCRN1基因的功能奠定了基础。
(4)采用组织化学法进行GUS基因瞬时表达检测表明,金丝慈竹愈伤组织可能有β-葡萄糖苷酸酶的本底活性,所以不适合利用本法进行筛选。
(5)金丝慈竹愈伤组织的抗生素敏感性测试表明,卡那霉素、PPT和潮霉素都不适用于金丝慈竹抗性愈伤组织筛选。