论文部分内容阅读
解聚素金属蛋白酶(adisintegrinandmetalloproteinase，ADAM)9基因启动子区多态性与散发性阿尔茨海默病(sporadicAlzheimersdisease，SAD)发病的关系及其机制，从而为SAD的发病机制提供实验和理论依据。
方法:随机选取10名SAD患者和10名正常对照者进行ADAM9启动子测序。用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(polymerasechainreaction—restrictionfragmentlengthpolymorphism，PCR—RFLP)方法或直接测序方法对中国汉族人群473例SAD患者和345例对照者进行多态性分型。用SPSS13.0统计软件包进行等位基因和基因型分布的比较及其与疾病的关联分析。选取双荧光报告基因系统(pGL3—Basic及pRL-TK)为报告基因载体，用基因重组和定点突变的方法构建含不同基因型启动子的报告基因质粒，转染于人神经母细胞瘤细胞(SH—SY5Y)、人宫颈癌上皮细胞(Hela)和人前列腺癌细胞(LNCaP)，检测荧光素酶的活性，计算相对荧光素酶活性(relativeluciferaseactivity，RLA)。同时检测分别用17β—雌二醇和5α—双氢睾酮处理后各启动子的效率。用生物素标记的各启动子探针分别与SH—SY5Y核提取物、Hela核提取物及LNCaP核提取物进行凝胶电泳迁移率实验(electrophoreticmobilityshiftassays，EMSA)，并用50或100倍未标记的自体及异体探针进行竞争抑制实验，检测每对探针与核转录因子的结合是否存在差别。
结果:
(1)中国人群中ADAM9启动子区存在四个多态性位点：—542C/T(rs10105311)、—600A/C(rs7840270)、—963A/G(rs6991968)和—1314T/C(rs7006414)。
(2)—1314T/C多态性在SAD和正常对照组中的基因型频率(P=0.0127)和等位基因频率(P=0.005)有显著性差异：不携带APOEε4的人群中—1314T/C多态性的基因型频率(P=0.004)及等位基因频率(P=0.002)存在更明显的显著性差异。CC+TC基因型可使发病风险降低至TT的0.648倍(OR=0.648，95％CI0.484-0.869，P=0.004)；不携带APOEε4的人群中CC+TC基因型可使发病风险降低至TT的0.594倍(OR=0.594，95％CI0.430-0.820，P=0.002)。
(3)所发现的4个多态性位点之间存在连锁不平衡关系，它们构成了一种相对降低AD危险性的单体型—542C/—600A/—963G/—1314C(OR=0.422，95％CI0.229-0.779，P=0.005)。
(4)双荧光基因报告分析表明，—542C/—600A/—963G/—1314C和—542C/—600A/—963A/—1314C单体型与—542C/—600A/—963A/—1314T单体型相比，均能够增加转录活性(分别为1.5～1.8倍和1.4～1.7倍)。17β—雌二醇处理后，上述三种单体型的转录活性在SH—SY5Y和LNCaP细胞中均较非处理组增高(P<0.05)。
(5)EMSA显示—1314T/C多态性位点的两等位基因之间存在核转录因子结合的差别，—1314C与核转录因子的结合力较强，不能够被100倍未标记的异体探针—1314T完全竞争抑制。
结论:
(1)—1314T/C多态性与AD发病有明显的相关性，—1314C等位基因具有保护即降低AD发病的作用，构建了保护性单体型—542C/—600A/—963G/—1314C。保护作用在APOEε4阴性的人群中更明显，可能独立于APOEε4而影响SAD发病。
(2)—1314T/C碱基的改变，可引起ADAM9启动子转录活性的改变。—1314C等位基因构成的单体型—542C/—600A/—963G/—1314C和—542C/—600A—963A/—1314C能够引起转录活性的增加，从而上调ADAM9基因的表达。EMSA研究证实—1314C与核转录因子的结合力强于—1314T。
(3)雌激素能够上调ADAM9启动子的表达，其可能是通过细胞内的转录因子雌激素受体，与ADAM9启动子区多个转录因子结合位点相结合而发挥作用。