研究背景:肺癌是常见的恶性肿瘤之一,同时也是一种严重危害人类身体健康的恶性肿瘤,其发病率和死亡率已高居各种肿瘤之首。流行病学调查研究显示,其主要的危险因素包括以下几种:吸烟、被动吸烟（如二手烟）、慢性支气管炎、肺结核、肺气肿、肿瘤家族病史、肺癌家族病史、生物燃料污染、电离辐射污染、空气和重金属污染等等。研究显示肺癌的5年生存率不到18%,目前最为常见的有效治疗肺癌的策略是全肺切除辅助化疗,而治疗肺癌的关键点是寻找有效的肺癌早期诊断和预后生物标志物,为下一步肺癌的治疗提供有效的科学依据。目前肺癌的治疗手段日新月异,针对不同类型肺癌采取的治疗措施和策略都有所不同,而确诊的的主要手段则是通过病理切片,该种方法的诊断精度高,但是在取样过程中由于各种因素无法准确对肺癌进行亚型定位,从而影响医生对患者的治疗策略的选择,故临床急需能够针对肺癌进行有效分型的生物标志物。近年来,长链非编码RNA（long non-coding RNAs,lncRNAs）在肿瘤中的表达模式、生物学效应逐渐为人所重视,而其越来越多的生物学机制正逐渐展现在大众面前。根据相关文献报道,在人类基因组中参与编码蛋白质的RNA约只占2%,超过98%的基因属于非编码RNA。这些非编码RNA曾经一度被认为是转录“噪音”,但是现在目前越来越多的科学研究显示,非编码RNA参与了体内多种生物学过程,其中包括转录过程,mRNA剪切,甚至翻译过程都有可能被非编码RNA所调控。长链非编码RNA（lncRNAs）作为非编码RNA的一种,日前受到越来越多的关注。lncRNAs是一般是指长度超过200nt的非编码RNA,大致分为:（1）正义链lncRNAs（Sense lncRNAs）,（2）反义链lncRNAs（Anti-sense lncRNAs or Divergent lncRNAs）,（3）双向lncRNAs（Bidirectional lncRNAs）,（4）基因间lncRNAs（Intergenic lncRNAs）和（5）基因内lncRNAs（Intronic lncRNAs）五大类。目前已有许多关于lncRNAs与肺癌相关的文献报道,如lncRNA MALAT1（metastasis associated in lung adenocarcinoma transcript 1）,在肺癌组织中高表达,而在癌旁组织中低表达,生物学功能揭示lncRNA MALAT1与肺癌的转移和预后相关,可能可以作为肺癌诊断和靶向治疗的标志。另外,lncRNA HOTAIR（HOX transcript antisense intergenic RNA）在肺癌组织中高表达,能够促进肺癌细胞在体内的侵袭和转移。课题组前期预实验使用8例肺癌组织进行RNA-seq检测发现loc101928809在肺癌组织中低表达,通过qRT-PCR技术检测发现,loc101928809在8对肺癌及对应的癌旁组织中低表达。因此本课题通过扩大样本含量检测loc101928809在癌组织和癌旁组织中的表达情况,发现loc101928809在肺癌组织中低表达。长链非编码RNA loc101928809位于chr4:77259122-77284273,长度为1685bp,含有3个外显子,其生物学类型是一条反义链非编码RNA,但是它的功能在正常细胞和癌细胞中尚不清楚,仍待研究。通过结合收集的临床资料分析发现,在非小细胞肺癌患者中,loc101928809在肺癌组织中的高表达与肺癌患者的严重程度,TNM分期有关;通过生存分析发现,高表达loc101928809的肺癌患者,中位生存期较长,而低表达loc101928809的肺癌患者,中位生存期较短,高表达loc101928809与肺癌患者的长生存期有关,通过分析loc101928809的高低表达情况的分层分析发现,loc101928809在各种因素作用下,都具普遍的保护作用,说明loc101928809在体内可能能够发挥保护效应,这些结果都提示我们loc101928809在非小细胞肺癌中可能发挥抑癌基因的效应。通过生物信息学发现,在loc101928809的上下游,分别有SDAD1-1,CXCL-9,CXCL-10,CXCL-11,均属于肿瘤免疫相关基因,SDAD1-1的主要功能是协助细胞趋化因子发挥生物学功能,CXCL-9,CXCL-10,CXCL-11属于趋化因子超家族,趋化因子的主要作用是吸引免疫细胞到免疫应答局部,参与免疫调节和病理反应,趋化免疫效应细胞渗入到达肿瘤部位。CXCL-9对激活的T淋巴细胞以及具有肿瘤浸润性质的淋巴细胞具有趋化作用,但是对粒细胞和单核细胞没有作用,CXCL9是Th1细胞的趋化剂,可以诱导CXCR³⁺T淋巴细胞浸润至肿瘤,介导抗肿瘤免疫;抑制肿瘤新生血管的形成;促进肿瘤细胞凋亡。趋化因子具有高效性特点,极微量水平即可发挥作用,与其他蛋白药物相比,具有提高疗效、降低成本、减轻病人痛苦等优点,因此正成为生物治疗的新热点。Weinberg于2011年发表肿瘤细胞的十大特征:自给自足生长信号（Self-Sufficiency in Growth Signals）;抗生长信号的不敏感（Insensitivity to Antigrowth Signals）;抵抗细胞死亡（Resisting Cell Death）;潜力无限的复制能力（Limitless Replicative Potential）;持续的血管生成（Sustained Angiogenesis）;组织浸润和转移（Tissue Invasion and Metastasis）;避免免疫摧毁（Avoiding Immune Destruction）;促进肿瘤的炎症（Tumor Promotion Inflammation）;细胞能量异常（Deregulating Cellular Energetics）;基因组不稳定和突变（Genome Instability and Mutation）。通过生物学信息分析,结合qRT-PCR试验结果,长链非编码RNA loc101928809可能通过调节CXCL-9的表达,影响肿瘤血管的生成和肿瘤免疫,引发肿瘤的炎症,从而引起肿瘤细胞的凋亡等,在肿瘤的发展过程中发挥抑癌基因的效应。科学假说:基于对编码RNA能够影响细胞的增殖、凋亡以及异常表达的非编码RNA能够发挥癌基因或者抑癌基因的生物学效应导致肿瘤发生发展的认识,针对loc101928809具有潜在调节细胞趋化因子的表达,提出loc101928809基因的表达和功能与人群肺癌有关的研究假说。目的:1.分析长链非编码RNA loc101928809在肺癌患者中的分布特征2.分析长链非编码RNA loc101928809在肺癌中的表达和功能研究材料和方法:本研究课题所使用到的276例肺癌组织及对应的癌旁组织来源于中国华南人群和中国华东人群,其中有182对组织标本的来源是从2008年至2015年收集于广州医科大学第一附属医院、广州医科大学附属肿瘤医院;另外94对肺癌组织标本则是来自于2009年至2015年收集于苏州大学附属第一医院。其中?60岁共156例,≥60岁患者共120例;男195例,女81例;有家族史者共计47例,无家族史者229例;有吸烟史者171例,无吸烟史者105例;有饮酒史者158例,无饮酒史者118例。本课题的研究对象,即患者间无血缘关系。为了验证loc101928809在肺癌中的表达量,通过qRT-PCR技术检测实验室276例肺癌组织及其对应癌旁组织中loc101928809的相对表达量,同时检测了loc101928809在肺癌细胞系和细胞核与细胞质中的表达量。为了分析loc101928809在肺癌中的分布特征,采用Logistic回归模型分析肺癌患者的临床特征及疾病进展的关联,采用Kaplan-Mieier法绘制生存曲线,并以log-rank检验不同因素所导致的生存时间差异,采用Cox风险回归分析loc101928809表达水平对肺癌预后的影响。为了分析loc101928809的生物学功能,构建loc101928809过表达、shRNA干扰及对应的过表达对照和shRNA对照的慢病毒表达载体,利用慢病毒包装技术感染人肺癌细胞系A549和PC-9,通过药物筛选出稳定的过表达、干扰的细胞进行后续的细胞功能学实验:利用CCK-8细胞增殖实验（一种类似于MTT的技术）检测异常表达的loc101928809对肺癌细胞系A549和PC-9增殖能力的影响;利用流式细胞仪技术检测异常表达的loc101928809对肺癌细胞系A549和PC-9周期和凋亡的影响;利用Transwell Migration及Invasion实验检测分析异常表达的loc101928809对肺癌细胞系A549和PC-9转移和侵袭能力的影响;利用软琼脂集落形成实验检测异常表达的loc101928809对肺癌细胞系A549和PC-9集落形成能力的影响;利用平板克隆实验检测异常表达的loc101928809对肺癌细胞系A549和PC-9克隆形成能力的影响;利用裸鼠成瘤实验检测异常表达的loc101928809对肺癌细胞系A549和PC-9在体内增殖能力的影响;利用裸鼠肿瘤尾静脉肺转移模型对异常表达的loc101928809在体内转移能力进行检测。对稳定过表达loc101928809及其shRNA干扰的A549和PC-9肺癌细胞系和相应的对照细胞系进行化学药物处理,探讨其可能的临床生物学效应,利用裸鼠成瘤实验检测异常表达的loc101928809通过药物处理后对肺癌细胞系A549和PC-9在体内增殖能力的影响。利用“RESCUE”实验技术探讨loc101928809与细胞趋化因子CXCL-9之间的生物学关联结果:1.通过qRT-PCR技术检测loc101928809的相对表达量发现,66.30%（183/276）的肺癌患者癌组织相对表达量低于癌旁组织,33.70%（93/276）的肺癌患者癌组织相对表达量高于于癌旁组织（Mean±SD,0.002298±0.003469 vs 0.001355±0.001523,P=0.028）。2.loc101928809主要在细胞核中表达。3.loc101928809在肺癌患者中的低表达与肺癌的临床进展（Ⅰ+Ⅱvs.Ⅲ+Ⅳ,P=0.0002）;淋巴结转移（N0 vs.N1+N2+N3,P=0.0033）;远处转移（M0 vs.M1,,P=0.0019）存在关联。loc101928809高表达的患者中位生存期高于loc101928809低表达患者(MST:18.0月vs.11.0月,P_{log rank}<0.05),分析发现,lnc-loc101928809高表达将降低肺癌患者的死亡风险达45%（HR=0.45,95%CI=0.3-0.68,P<0.05）。4.通过筛选两株稳定转染的细胞系（A549和PC-9）稳定高表达loc101928809、稳定低表达（干扰）loc101928809以及相应的高表达和低表达对照细胞,进一步进行细胞生物学功能实验,通过CCK8细胞增殖实验发现,A549和PC-9细胞系均显示,loc101928809高达组细胞的生长速率低于对照组,loc101928809干扰组的细胞生长速率高于对照组（P<0.05）。5.通过平板克隆实验发现,loc101928809稳定高表达组的细胞克隆数低于对照组的细胞克隆数,稳定低表达组的细胞克隆数高于对照组的细胞克隆数（P<0.05）。通过软琼中集落形成实验发现,loc101928809稳定高表达组的细胞的集落形成数明显低于对照组的细胞集落形成数,干扰组明显高于对照组细胞的集落形成数（P<0.05）。6.通过流式细胞仪检测稳定转染细胞的周期和凋亡。周期检测发现loc101928809稳定高表达组的细胞与低表达组的细胞相比,休眠期细胞及分裂前期细胞增多（G0-G1期）,DNA合成后期及分裂期细胞减少（G2-M期）,提示高表达的loc101928809能够使细胞停滞在G0-G1期,并且减少细胞进入G2-M期,从而抑制细胞分裂增殖。凋亡实验显示,loc101928809稳定高表达够促进细胞凋亡,干扰loc101928809可以抑制细胞凋亡（P<0.05）。7.通过Transwell Migration实验发现,在A549和PC-9两组细胞系中,loc101928809稳定高表达组的细胞穿透小室的细胞数量少于对照组细胞所穿透的细胞（P<0.05）,而其loc101928809稳定低表达组的细胞穿透小室的细胞数量多于对照组所穿透的细胞（P<0.05）。通过Tranwell Invasion实验发现,在A549和PC-9两组细胞系中,loc101928809稳定高表达组的细胞穿透小室的细胞数量少于对照组细胞所穿透的细胞数量（P<0.05）,而其loc101928809稳定低表达组的细胞穿透小室的细胞数量多于对照组所穿透的细胞数量（P<0.05）。8.通过化学药物处理稳定转染的A549和PC-9两组细胞系发现,采用顺铂药物处理稳定转染的高表达,低表达以及对应的对照组细胞,发现A549细胞IC50%为8ug/ml,PC-9细胞系的IC50%分别为32ug/ml,采用流式细胞仪检测顺铂处理细胞的周期和凋亡发现,当分别使用IC50%的浓度处理loc101928809稳定转染的高表达组,低表达组以及相应应的对照组细胞,采用流式细胞仪技术检测药物处理后细胞的周期和凋亡,周期检测发现loc101928809稳定高表达组的细胞与低表达组的细胞相比,休眠期细胞及分裂前期细胞增多（G0-G1期）,凋亡实验发现,loc101928809稳定高表达明显够促进细胞凋亡,干扰loc101928809可以抑制细胞凋亡（P<0.05）,说明loc101928809稳定高表达对于在顺铂治疗中具有增敏作用。通过采用不同浓度的顺铂处理稳定高表达组,低表达组和相应的对照组细胞,通过CCK8细胞增殖实验发现,不同浓度下,稳定高表达组细胞的增殖能力低于对照组细胞,稳定低表达组细胞的增殖能力高于对照组细胞的增殖能力（P<0.05）。通过使用IC50的浓度处理细胞72小时,每隔12小时测量发现,高标组细胞的IC50比对照组有所提前,而低表达组细胞的IC50有所延后;通过裸鼠成瘤药物治疗实验发现,稳定高表达组细胞在体内的生长速度低于对照组,稳定低表达组细胞在体内的生长速度高于对照组（P<0.05）,高表达组细胞的裸鼠通过药物治疗后可使肿瘤消失,生长状态良好,而低表达组细胞老鼠明显消瘦,而且发生死亡。高表达组的裸鼠的中位生存时间为53天,其对照组的MST为36天（P<0.05）;低表达组的MST为28天,其对照组的MST为40天（P<0.05）。9.裸鼠成瘤实验显示稳定高表达组细胞在体内的生长速度低于对照组,稳定低表达组细胞在体内的生长速度高于对照组(P<0.05。裸鼠尾静脉注射肺转移模型中发现,稳定转染的A549与PC-9两株肺癌细胞系均变现高表达的loc101928809将抑制肺癌细胞的转移,低表达的loc101928809促进肺癌细胞系在体内的转移能力,且HE染色切片确认发生转移的为肿瘤细胞。10.通过生物信息学分析,loc101928809与趋化因子CXCL-9有关。经qRT-PCR技术检测发现,CXCL-9在肺癌组织中低表达,在其对应的癌旁组织中高表达（P<0.05）,CXCL-9的表达与loc101928809的表达呈正相关（r=0.3286,p=0.0014）.通过ELISA双抗体夹心法检测细胞培养基中CXCL-9的含量发现,在稳定转染loc101928809的高表达,低表达及其相应的对照组细胞株中得到同样的趋势,与对照组细胞相比,loc101928809高表达后,细胞培养液中CXCL-9的含量也呈高表达,loc101928809低表达后,细胞培养液中CXCL-9的含量也呈低表达。“RESCUE实验”发现,当高表达loc101928809与低表达的CXCL-9共转染细胞后,通过CCK8细胞增殖实验发现,共转染组细胞的增殖能力高于loc101928809高表达组细胞（P<0.05）,有向对照组“回复”的能力,同时平板克隆也发现同样的结果,周期和凋亡检测发现,共转染细胞组的凋亡率低于loc101928809高表达组的凋亡率,说明loc101928809与趋化因子CXCL-9有生物学关联。结论:1.loc101928809在肺癌组织中低表达,且与患者临床进展有关;loc101928809的高表达能明显改善肺癌患者的预后。2.体外实验表明loc101928809的过表达能够抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,促进肺癌细胞的凋亡;体内动物实验显示,皮下和尾静脉注射裸鼠,其肿瘤生长趋势受到抑制,转移癌灶明显减少。3.通过裸鼠种植瘤的顺铂治疗,显示高表达loc101928809后,裸鼠的生存时间显著延长,而低表达loc101928809的生存时间明显缩短,loc101928809对于顺铂治疗具有易感性。4.CXCL-9与loc101928809表达呈显著正相关。本研究创新之处:本研究通过利用单纯病例研究的方法,首次报道长链非编码RNA loc101928809与肺癌发生发展的关系;并通过一系列的细胞生物学实验证实了loc101928809可以通过影响CXCL-9基因表达,从而影响肺癌的发展。本研究的不足之处:本研究虽然证实了在肺癌的发生发展中loc101928809与肺癌之间存在关联。但是,loc101928809与CXCL-9作用的具体机制尚未研究清楚研究总结:loc101928809在肺癌组织中高表达,可能抑制肺癌患者临床进展、延长肺癌患者生存期,同时对于顺铂类药物的治疗具有增敏作用,提示loc101928809可作为肺癌进展和预后的生物标志物。