苯并[a]芘对大鼠肝脏生物标志物的研究

来源 :大连医科大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:q28100125
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目的:检测苯并[a]芘(BaP)染毒大鼠肝组织中3-羟基苯并[a]芘(3-OHBaP)、(+)-anti-7,8-二氢二醇-9,10-环氧苯并[a]芘(BPDE)-DNA加合物、超氧化物歧化酶、还原型谷胱甘肽、丙二醛、8羟基脱氧鸟苷的含量,研究其变化规律以及苯并[a]芘对大鼠肝脏组织的暴露生物标志物和效应生物标志物的可行性。方法:准确称取一定量的BaP标准品溶于玉米油中,配置成高剂量100mg/kg、中剂量50mg/kg、低剂量5mg/kg的灌胃液待用。雄性SD大鼠224只,体重180-220g,随机分为A、B、C、D四个组。A、B、C三个组为暴露组,分别为高、中、低剂量组,每组56只。D组为非暴露空白组。所有大鼠处理前12h禁食,自由饮水。A、B、C组分别灌胃2mL高剂量、中剂量、低剂量溶液,D组灌胃2mL空白玉米油。并于灌胃后0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h共7个时间点断头处死大鼠,迅速取出肝置于生理盐水中,洗净,滤纸吸干组织表面水份,称取脏器湿重,平均分成2份,一份装袋密封,另一份加4倍生理盐水匀浆,制成组织匀浆液,2份均-20℃保存。取大鼠肝组织匀浆液样品100μL于离心管中,加入200μL乙腈,涡旋混合1min,离心10min(10000r/min),取20μL上清液,利用高效液相色谱-荧光法在甲醇/水(97/3),pH=4.5,流速:0.5mL/min,激发波长:365nm,检测波长:450nm的色谱条件下外标法检测3-OHBaP在大鼠肝组织中的含量。将解冻的大鼠肝组织用解剖刀切成小碎块,取50mg组织用组织基因组DNA提取试剂盒处理,提纯的组织总DNA在0.1moL/L HCL、90℃恒温水浴箱中水解4h,乙酸乙酯提取酸水解产物——苯并[a]芘-四醇,挥干乙酸乙酯,加入200μL二甲基亚砜复溶,取20μL,利用高效液相色谱-荧光法在甲醇/水(55/45),pH=7.0,流速:1.0mL/min,激发波长:245nm,检测波长:395nm的色谱条件下外标法检测苯并[a]芘-四醇在大鼠肝组织中的含量,以其来间接反应(+)-anti-BPDE-DNA加合物在大鼠肝组织中的含量。分别用超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒、微量还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒、大鼠8羟基脱氧鸟苷(8-OHDG)酶联免疫分析试剂盒、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒测定大鼠肝组织中SOD、GSH、MDA、8-OHDG的含量及蛋白浓度。用SPSS17.0软件对结果进行统计分析,符合正态分布,以均值±标准差表示,并用Pearson法分析染毒剂量与两种代谢产物含量的相关性。结果:除了低剂量染毒组检测不出(+)-anti-BPDE-DNA加合物,高、中剂量染毒组均可检测出3-OHBaP和(+)-anti-BPDE-DNA加合物。染毒剂量和BaP代谢产生的3-OHBaP、(+)-anti-BPDE-DNA加合物存在显著正相关(p<0.01)。染毒剂量和MDA、8-OHDG存在正相关。染毒后大鼠肝脏内GSH含量在低剂量时最多,随着染毒浓度的增加而减少。染毒后大鼠肝脏内SOD含量随染毒浓度的增高而增多,在中剂量时最多,随后下降。结论:3-OHBaP和(+)-anti-BPDE-DNA加合物可考虑为大鼠肝组织BaP的暴露生物标志物,SOD、GSH、MDA、8-OHDG可考虑为大鼠肝组织的效应生物标志物。
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