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目的:
1.Wnt信号通路在结直肠癌(CRC)的发生发展过程中起着重要的作用.凡是可以阻断这种信号转导的小分子物质或干预影响Wnt通路活性的相关基因,均可以成为潜在有效治疗结直肠癌的靶标.因此,我们旨在通过不同的方法干预Wnt信号通路,进一步研究Wnt通路变化对结直肠癌发生发展的作用及其调控机制.
2.FH535是Wnt通路的小分子抑制剂,研究表明它能通过不同方式抑制Wnt通路,但具体的作用机制尚不明确.通过体外细胞实验研究FH535对结直肠癌细胞DLD-1和SW620的增殖、迁移和侵袭的作用,并对其作用机制进行初步探讨,有助于了解调控Wnt信号通路的机制及其对结肠直肠癌发生发展的影响.
3.不同活性的Wnt通路影响着结直肠癌的发生发展.高Wnt通路活性能通过维持结直肠癌干细胞(CSC)前体的活性,促进结肠炎向结直肠癌转变,导致结直肠癌的发生和进展.因此,通过生物信息学的方法筛选出引起不同Wnt活性的差异表达基因(DifferentExpressionGene,DEG),并对这些基因进行分析,鉴定,有助于了解调控Wnt信号通路的机制及其对结肠直肠癌发生发展的影响.
方法:
1.为研究Wnt通路小分子抑制剂FH535对结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响,实验分为对照组(0μmol/L),FH535低浓度组(20μmol/L),中浓度组(40μmol/L),高浓度组(80μmol/L),采用CCK-8法、软琼脂克隆形成实验法检测FH535对人结肠癌细胞增殖的抑制作用,流式细胞术检测FH535对细胞周期的影响,划痕法和Transwell检测FH535对人结肠癌细胞迁移和侵袭的抑制作用,qPCR检测细胞β-catenin、Cyclin-A2和Claudin-1的mRNA表达水平,Westernblot分析细胞β-catenin、Cyclin-A2和Claudin-1的蛋白表达水平.
2.为鉴定引起不同Wnt活性的差异基因对结直肠癌的影响,我们通过GEO公开数据库,选取了GSE32408,GSE17375和GSE33112三个数据集,并用GEO2R在线数据分析工具选定不同Wnt活性分组,运用高通量测序技术分析出不同分组的差异基因(DEG).此外,基因本体论(GO)和信号通路(KEGG)富集分析由DAVID数据库进行,分别对这些差异基因进行功能注释.蛋白质-蛋白质相互作用网络(PPI)由STRING数据库构建.Cytoscape中的插件Cyto-hubba用于获取蛋白质互作网络的基因分数.然后我们在Cyto-hubba的12种算法中选择算法相对较高得分的蛋白质,并使用Funrich获得蛋白调控网络中的6个关键基因.然后,我们通过Oncomine数据库,在结直肠癌和正常组织的不同样本中对6个关键基因进行了mRNA的总表达水平分析,验证了6个关键基因的临床意义.最后我们通过qPCR实验验证了6个关键基因FGA,A2M,IGF1,TGFB2,PDGFB和SERPINC1在结肠癌细胞系DLD-1、SW620和正常结肠上皮细胞NCM460的mRNA表达水平.并用Wnt通路抑制剂FH535阻断后,观察6个关键基因mRNA表达水平变化.
结果:
1.Wnt通路小分子抑制剂FH535对结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的实验中,我们发现FH535可以浓度依赖性和时间依赖性方式显著抑制DLD-1和SW620细胞的生长.同时细胞周期试验结果表明,FH535可显著诱导结直肠癌细胞G2/M期阻滞.伤口愈合实验和Transwell显示FH535显着抑制细胞迁移和侵袭.此外,我们发现FH535下调了β-catenin和CyclinA2的mRNA和蛋白水平表达,同时上调mRNA和蛋白水平的Claudin-1表达,这可能是FH535抑制人结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的机制之一.
2.鉴定引起不同Wnt活性的差异基因对结直肠癌的影响的研究中,三个数据库GSE32408,GSE17375和GSE33112筛选出总共102个共同的差异基因(DEG),例如TIAM1,A2M和MMP13等.GO功能富集分析显示,这些基因与免疫,细胞外物质和结合相关物质有关.KEGG通路分析与癌症,间隙连接和癌症中的蛋白多糖的途径有关.蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建和计算筛选出了6个核心基因,包括FGA,A2M,IGF1,TGFB2,PDGFB和SERPINC1,并且用Oncomine数据库分析了它们的总体表达在结直肠癌中和正常结肠组织中的mRNA水平有显著差异.单个芯片数据中也同样验证了FGA,A2M,IGF1,TGFB2,PDGFB和SERPINC1在结肠癌和正常结肠临床样本中的表达差异,这表明它们可能在结直肠癌的进展中起重要作用.进一步的qPCR实验证明,FGA,A2M,IGF1,TGFB2,PDGFB和SERPINC1在结肠癌细胞DLD-1、SW620和正常结肠上皮细胞NCM460的mRNA水平有显著差异.Wnt抑制剂FH535使用后,FGA,A2M,IGF1,TGFB2,PDGFB和SERPINC1的mRNA同样发生显著变化,表明以上6个关键基因可能影响Wnt通路的不同活性.
结论
1.我们的研究表明,FH535通过调节CyclinA2和Claudin1基因表达来抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭,进一步丰富了FH535的调节机制网络,也有助于促进FH535成为结直肠癌治疗的靶向药的研究.
2.我们的研究发现102个差异基因和6个核心基因可能参与引起不同Wnt活性以及维持结直肠癌干细胞(CSCs)的特征,这些基因可能在结直肠癌的发生发展中起重要作用,可做进一步深入的研究.
1.Wnt信号通路在结直肠癌(CRC)的发生发展过程中起着重要的作用.凡是可以阻断这种信号转导的小分子物质或干预影响Wnt通路活性的相关基因,均可以成为潜在有效治疗结直肠癌的靶标.因此,我们旨在通过不同的方法干预Wnt信号通路,进一步研究Wnt通路变化对结直肠癌发生发展的作用及其调控机制.
2.FH535是Wnt通路的小分子抑制剂,研究表明它能通过不同方式抑制Wnt通路,但具体的作用机制尚不明确.通过体外细胞实验研究FH535对结直肠癌细胞DLD-1和SW620的增殖、迁移和侵袭的作用,并对其作用机制进行初步探讨,有助于了解调控Wnt信号通路的机制及其对结肠直肠癌发生发展的影响.
3.不同活性的Wnt通路影响着结直肠癌的发生发展.高Wnt通路活性能通过维持结直肠癌干细胞(CSC)前体的活性,促进结肠炎向结直肠癌转变,导致结直肠癌的发生和进展.因此,通过生物信息学的方法筛选出引起不同Wnt活性的差异表达基因(DifferentExpressionGene,DEG),并对这些基因进行分析,鉴定,有助于了解调控Wnt信号通路的机制及其对结肠直肠癌发生发展的影响.
方法:
1.为研究Wnt通路小分子抑制剂FH535对结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响,实验分为对照组(0μmol/L),FH535低浓度组(20μmol/L),中浓度组(40μmol/L),高浓度组(80μmol/L),采用CCK-8法、软琼脂克隆形成实验法检测FH535对人结肠癌细胞增殖的抑制作用,流式细胞术检测FH535对细胞周期的影响,划痕法和Transwell检测FH535对人结肠癌细胞迁移和侵袭的抑制作用,qPCR检测细胞β-catenin、Cyclin-A2和Claudin-1的mRNA表达水平,Westernblot分析细胞β-catenin、Cyclin-A2和Claudin-1的蛋白表达水平.
2.为鉴定引起不同Wnt活性的差异基因对结直肠癌的影响,我们通过GEO公开数据库,选取了GSE32408,GSE17375和GSE33112三个数据集,并用GEO2R在线数据分析工具选定不同Wnt活性分组,运用高通量测序技术分析出不同分组的差异基因(DEG).此外,基因本体论(GO)和信号通路(KEGG)富集分析由DAVID数据库进行,分别对这些差异基因进行功能注释.蛋白质-蛋白质相互作用网络(PPI)由STRING数据库构建.Cytoscape中的插件Cyto-hubba用于获取蛋白质互作网络的基因分数.然后我们在Cyto-hubba的12种算法中选择算法相对较高得分的蛋白质,并使用Funrich获得蛋白调控网络中的6个关键基因.然后,我们通过Oncomine数据库,在结直肠癌和正常组织的不同样本中对6个关键基因进行了mRNA的总表达水平分析,验证了6个关键基因的临床意义.最后我们通过qPCR实验验证了6个关键基因FGA,A2M,IGF1,TGFB2,PDGFB和SERPINC1在结肠癌细胞系DLD-1、SW620和正常结肠上皮细胞NCM460的mRNA表达水平.并用Wnt通路抑制剂FH535阻断后,观察6个关键基因mRNA表达水平变化.
结果:
1.Wnt通路小分子抑制剂FH535对结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的实验中,我们发现FH535可以浓度依赖性和时间依赖性方式显著抑制DLD-1和SW620细胞的生长.同时细胞周期试验结果表明,FH535可显著诱导结直肠癌细胞G2/M期阻滞.伤口愈合实验和Transwell显示FH535显着抑制细胞迁移和侵袭.此外,我们发现FH535下调了β-catenin和CyclinA2的mRNA和蛋白水平表达,同时上调mRNA和蛋白水平的Claudin-1表达,这可能是FH535抑制人结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的机制之一.
2.鉴定引起不同Wnt活性的差异基因对结直肠癌的影响的研究中,三个数据库GSE32408,GSE17375和GSE33112筛选出总共102个共同的差异基因(DEG),例如TIAM1,A2M和MMP13等.GO功能富集分析显示,这些基因与免疫,细胞外物质和结合相关物质有关.KEGG通路分析与癌症,间隙连接和癌症中的蛋白多糖的途径有关.蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建和计算筛选出了6个核心基因,包括FGA,A2M,IGF1,TGFB2,PDGFB和SERPINC1,并且用Oncomine数据库分析了它们的总体表达在结直肠癌中和正常结肠组织中的mRNA水平有显著差异.单个芯片数据中也同样验证了FGA,A2M,IGF1,TGFB2,PDGFB和SERPINC1在结肠癌和正常结肠临床样本中的表达差异,这表明它们可能在结直肠癌的进展中起重要作用.进一步的qPCR实验证明,FGA,A2M,IGF1,TGFB2,PDGFB和SERPINC1在结肠癌细胞DLD-1、SW620和正常结肠上皮细胞NCM460的mRNA水平有显著差异.Wnt抑制剂FH535使用后,FGA,A2M,IGF1,TGFB2,PDGFB和SERPINC1的mRNA同样发生显著变化,表明以上6个关键基因可能影响Wnt通路的不同活性.
结论
1.我们的研究表明,FH535通过调节CyclinA2和Claudin1基因表达来抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭,进一步丰富了FH535的调节机制网络,也有助于促进FH535成为结直肠癌治疗的靶向药的研究.
2.我们的研究发现102个差异基因和6个核心基因可能参与引起不同Wnt活性以及维持结直肠癌干细胞(CSCs)的特征,这些基因可能在结直肠癌的发生发展中起重要作用,可做进一步深入的研究.