2019年3月,河南省某养殖场暴发严重的疾病,导致加州鲈（Micropterus salmoides）大批死亡,主要症状为肌肉溃烂、体表及鳍条出血、肝脏肿大、有腹水等。为弄清此次疾病的病原,探讨其致病机制,本实验对患病加州鲈进行病原学、病理学等方面的研究,确定致病菌为维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）,并克隆了维氏气单胞菌OmpA基因,对其序列、蛋白质结构、B细胞抗原表位等进行生物信息学分析,此外,还制备了OmpA基因缺失株,为OmpA基因在维氏单胞菌中的功能研究提供基础。1.患病加州鲈病原的分离鉴定与分析。对发病濒死的加州鲈病变组织进行了病毒和寄生虫性病原的检查,检查到锚头鳋,未检测到病毒。同时又进行了细菌分离,从患病加州鲈肝脏、肾脏和溃烂处分离得到1株优势菌HN1903,对其形态特征、理化特性、分子特征、毒力基因携带情况、回归感染实验以及引起加州鲈的组织病理变化进行了研究。结果显示:分离株HN1903为革兰氏阴性短杆菌,经测序、系统发育分析和生理生化检测,表明该菌与维氏气单胞菌相似性最高。将HN1903回归感染健康的加州鲈,鱼体发病症状与临床自然发病症状一致,并且测得该株菌对加州鲈半数致死剂量为5.01×10~6cfu/m L。综合以上结果,确定患病加州鲈的病原为维氏气单胞菌,并检测到该株菌携带aer A、gca T、act、fla、lip、Ser、hly A、ahy B 8种毒力基因,具有β溶血活性和蛋白酶活性。在供试的12种抗菌药物中,菌株HN1903对庆大霉素和头孢噻肟高度敏感,对氟苯尼考和链霉素中度敏感,对复方新诺明、诺氟沙星、四环素等8种药物不敏感。该病原菌可引起加州鲈多个组织器官的损伤,主要表现为肝血窦淤血,肝细胞轮廓模糊,出现溶解坏死,肾小球腔体变大,肾小管囊腔肿大,肾小管上皮细胞溶解坏死,脾脏含铁血黄素颗粒增多,鳃小片基部细胞增生,鳃小片细胞脱落,导致鳃小片变短。综合以上结果判断该养殖场患病加州鲈的病因可能是锚头鳋寄生到其体表,造成体表受损,此时维氏气单胞菌趁机从受损部位入侵鱼体,最终导致加州鲈患病。2.维氏气单胞菌OmpA基因的克隆及生物信息学分析。PCR扩增维氏气单胞菌HN1903株的外膜蛋白A基因,对OmpA蛋白理化特性、结构和B细胞抗原表位进行预测分析。从系统进化关系图中可以看出HN1903株的OmpA氨基酸序列与维氏气单胞菌聚为一支,同源性最高。OmpA序列全长1035 bp,编码344个氨基酸,蛋白分子质量为36.9 k Da,理论等电点5.43。OmpA含有信号肽,具有革兰氏阴性菌所特有的β桶状结构,并且该结构由6个反向平行的β折叠片构成。OmpA为跨膜蛋白,具有拓扑结构。维氏气单胞菌HN1903株OmpA的主要线性B细胞抗原表位共有10个,其中有3个暴露于细菌表面,可作为疫苗候选抗原。3.维氏气单胞菌OmpA基因缺失株的制备。本研究以维氏气单胞菌HN1903株的DNA为模板扩增OmpA基因上、下游同源臂,PCR重叠成一个片段,并连接到p DM4自杀载体中,成功构建了敲除质粒p DM4-?OmpA。大肠杆菌体内的敲除质粒通过两菌接合转移到维氏气单胞菌中,与OmpA基因发生第一次同源重组。利用10%蔗糖平板筛选第二次重组成功的维氏气单胞菌,最终得到OmpA基因敲除的维氏气单胞菌缺失株。本研究获得的OmpA基因敲除菌株,为OmpA基因功能的研究提供了基础。