作为一种重要的实验动物模型，猪在生物医学领域得到了日益广泛的应用。猪在生理、解剖，发育及疾病发展过程中都与人极为相似，并且作为一种已溶入人类社会生活的家畜，猪在成本、饲养、管理等方面都具有无与伦比的优势。本实验室已建立起成熟的体细胞核移植克隆猪平台，基于此平台，本研究在猪的基因修饰(转基因/基因敲除)及其应用方面做了一定的探索，旨在进一步推进猪作为实验动物在人类健康、疾病模型等方面的研究和应用。这里主要有两方面的工作：一是Mx1转基因猪在抗病毒育种上的应用；二是探讨以锌指核酸酶制备基因敲除猪。　　 Mx1是Ⅰ型干扰素诱导下游蛋白中的一类，具有广泛的抗病毒功能。其对许多RNA病毒，例如流感病毒，疱疹性口炎病毒，托高土病毒，汉坦病毒，狂犬病毒等都有抗性，甚至对DNA病毒，如乙型肝炎病毒也有一定的作用。本研究基于猪在流感病毒感染和传播途径中的特殊性，尝试制备了Mx1转基因猪。由于猪的呼吸道上皮细胞表面同时具有识别禽流感病毒的唾液酸α-2，3半乳糖苷受体和识别人流感病毒的唾液酸α-2，6半乳糖苷受体，因此猪既可以感染人流感病毒又可以感染禽流感病毒。研究认为在流感病毒传播过程中，猪可能承担了流感病毒基因重组发生混合器的角色，禽、人流感病毒通过自然途径传播给猪，并在猪体内发生重组变异后传播给人。近年来频频爆发的人感染禽流感、猪流感疫情显示流感病毒的这种传播途径是极具危害性的。若能提高猪对流感病毒的抗性，流感病毒在猪体内复制和重组并发生变异的机率必然降低，其产生对人具有更强感染力或致病力的病毒的机率也会降低，这对于人类健康和公共卫生无疑具有及其重要的意义。　　 我们将猪自身的Mx1基因与EGFP以2A序列串联，构建转基因载体。筛选转基因细胞后进行了核移植，共获得5只转基因猪，经鉴定5只转基因猪都能有效表达外源Mx1基因。分别以A型流感病毒(A/PR/8/34(H1N1)，A/Vietnam/1194/2004(H5N1))和猪瘟病毒(CSFV)感染分离自转基因猪耳朵组织的成纤维细胞，发现A型流感病毒和CSFV在细胞上的复制都能被Mx1转基因明显抑制。以A型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)感染试验猪后虽然没有观察到明显的症状，但经测量体温可发现转基因猪攻毒组的平均体温与对照组的猪平均体温基本一致，而非转基因猪攻毒组的平均体温从攻毒后第3天开始要高于转基因猪和对照组猪。攻毒后第3、5、7天，转基因猪血清抗体滴度水平要低于非转基因猪。本研究显示了Mx1转基因对克隆猪的保护作用，为开发具有抗病毒能力的猪提供了新的选择。　　 另一方面，本研究在锌指核酸酶(ZFN)在猪基因打靶上的研究做了新的尝试。由于缺乏能在有效的胚胎干细胞系，猪的基因打靶效率极其低下，以致该领域的进展极为缓慢。锌指核酸酶的高效基因组编辑能力和广泛的适用性为高效制备基因敲除猪提供了突破口。本研究靶向猪的PPARγ基因，设计了3对锌指核酸酶，经过筛选，有一对锌指能有效发挥其靶向切割能力。以该锌指核酸酶转染猪胎儿成纤维细胞，经过富集筛选，共计从244个细胞克隆中鉴定出7个阳性细胞克隆，基因打靶效率为2.8％，相比于正常同源重组低于10-6的打靶效率，锌指对体细胞基因打靶效率有着本质的提高。核移植基因打靶细胞共获得2只单拷贝PPARγ基因敲除的克隆猪，这是首次成功运用ZFN对猪进行基因打靶，并为对其它大动物进行基因打靶开辟了一条新的途径。